农杆菌介导RNAi大豆花叶病毒HC-Pro基因大豆遗传转化的研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:GPSCMP
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大豆[Glycine max(L.)Merr.]起源于中国,是人类植物性蛋白和食用油的主要来源,它在我国国民膳食体系中扮演着重要角色。大豆花叶病毒(Soybeansaic virus SMV)引致的病毒病是一种全球性病害,它造成大豆大幅减产和品质恶化。传统的抗病育种技术在当前大豆病毒防治领域仍然处于主导地位,但对SMV的抗性具有株系专化性,因此传统方法很难在短时间内培育出对SMV具有广谱抗性的品种。转基因技术可以打破物种间的屏障,在较短时期内完成优良抗性基因的定向改造、重组和转移,能够极大地缩短抗病品种的选育进程。尤其是RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术已成为培育抗病毒转基因作物的热门方法。因此,本研究旨在借助转基因手段将SMV自身HC-Pro基因部分保守片段的反向重复序列(Inverted repeat sequences,IRs)导入大豆中,借助RNAi机制引发RNA沉默(RNA silencing),即序列特异性的转录后基因沉默(Post-transcriptional gene silencing,PTGS),从而诱发 RNA 介导的抗性(RNA-mediated resistance),即源于病原诱导的抗性(Pathogen-derived resistance,PDR),最终培育出对SMV具有广谱、持久抗性的转基因大豆新材料。另外,大豆转基因抗病育种以及阐明抗病机理的理论研究都需要功能明确的SMV抗病基因作为物质基础。但大豆转化效率偏低,直接利用转基因大豆验证SMV抗病候选基因的功能存在很大难度。本氏烟(Nicotiana benthamiana)的转化简单且高效,是验证抗病候选基因的理想模式植物。然而,没有系统侵染本氏烟的SMV分离物便成为制约它的应用的关键。因此,本研究期望筛选到能够侵染本氏烟的SMV株系的分离物,为应用转基因本氏烟验证SMV抗病候选基因的功能奠定基础。主要研究结果如下:1.RNAi载体的构建对国内外11个SMV流行株系的全基因组序列进行核苷酸序列同源性比对,确定出SMV HC-Pro基因的保守区间,从中选择长度为268 bp(2043 bp-2310 bp)的核苷酸序列作为RNAi目标区段HC-Proi。以SC3株系的cDNA为模板克隆出高度保守的268 bp干扰片段,进而利用GATEWAY技术构建了适合农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导大豆遗传转化的RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)-HC-Proi·。对BP反应和LR反应的纯化产物进行了测序鉴定,测得序列在NCBI上进行比对,匹配度为100%;对RNAi重组载体进行PCR鉴定,扩增得到464 bp和478 bp两个片段,说明HC-Proi与pB7GWIWG2(Ⅱ)发生了同源重组并且形成了反向重复结构;对重组质粒进行酶切鉴定,经过XbaI单酶切后出现783 bp和10818 bp两条带,经过EcoRI和HindⅢ双酶切后出现2256 bp和9346 bp两条带,说明HC-Proi与pB7GWIWG2(Ⅱ)发生了同源重组并且同时取代了两个ccdB位点。最终将鉴定正确的RNAi重组载体通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105中。2.大豆遗传转化体系的优化应用农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,选取17个国内外大豆栽培品种,利用农杆菌菌株EHA105和载体pCAMBIA3301,借助GUS染色手段,对大豆基因型、氯气灭菌时间、外植体类型、菌株活力、侵染液浓度、侵染时间和共培养天数等方面进行了优化。结果表明:最佳氯气灭菌时间为14-18 h;最佳外植体类型为萌发24 h的外植体;最佳农杆菌菌液浓度为OD600nm=0.8-1.0;最佳侵染液浓度为OD600nm=0.6-0.8;最佳侵染时间为30 min;最佳暗培养天数为4 d。综合上述优化的结果,最终筛选出了适合该转化方法的天隆1号、华春3号、华春6号、Williams 82和Jack5个易感和高再生大豆基因型。3.SMVHC-Pro基因的遗传转化利用已优化的农杆菌介导大豆子叶节的遗传转化体系,选用大豆品种天隆1号、华春3号、华春6号、Williams 82和Jack为受体材料,以萌发24 h的成熟大豆子叶节为外植体,以bar基因作为筛选标记进行大豆转基因实验。通过种子萌发、外植体制备、农杆菌侵染液制备、侵染、共培养、丛生芽诱导、芽伸长、生根、炼苗、驯化、移栽的组织培养过程,共计获得抗性组培幼苗233株。通过除草剂涂抹鉴定植株的除草剂抗性;通过PCR检测35S启动子(449bp)、35S终止子(435 bp)和bar基因(402 bp);通过PAT/bar转基因检测试纸对植株进行鉴定(阳性植株同时出现控制线和检测线)。共筛选出阳性T0代转基因大豆植株105棵,5个受体品种的转化率在0.70%-3.07%之间,平均转化率为2.30%。4.转基因大豆T1和T2代对SMV的抗病鉴定对已获得的105棵阳性T0代转基因大豆植株进行加代繁殖,共获得1605株T1后代,从中检测出1059裸阳性植株。Southern blot杂交实验证明,T-DNA以低拷贝的整合方式插入大豆基因组中。卡方(χ2)测验结果显示,大部分To家系的T1代分离比符合3:1或15:1(P>0.05),即符合孟德尔1对或2对基因的遗传规律。通过SMV抗病鉴定实验,共筛选到T1代高抗SMV转基因大豆植株441棵。花期倒三叶SMV发病等级的调查结果表明,1059棵阳性T1代转基因大豆植株的平均SMV发病等级为1.42,而5个基因型非转基因植株的平均SMV发病等级高达3.2。阳性T1代植株和非转基因植株在接种SMV 15 d和30 d后进行了 qRT-PCR分析,结果表明SMV含量在转基因植株体内呈下降趋势,在非转基因植株中则迅速增加。接种SMV 2个月后的DAS-ELISA实验证明,在阳性T1代植株的体内已经检测不到病毒的存在。我们进一步对75棵阳性T2代转基因植株进行了 SMV抗病鉴定,其中有57棵被鉴定为高抗类型,并且没有发现感病类型的植株。阳性T2代转基因植株在接种SMV 3周后和5周后进行了 DAS-ELISA实验,结果表明SMV在植株体内呈现为阴性或是含量逐渐降低。此外,我们还对抗病转基因大豆植株的T3种子进行了观察,并未发现SMV所导致的褐斑粒的出现。5.应用转基因本氏烟验证SMV抗病候选基因功能的初步探索从中国21个SMV株系(SC1-SC21)中挑选出37个病毒分离物,分别对本氏烟进行人工接种。当本氏烟植株接种SMV株系SC7(包括分离物S9和S10)时:植株的上位叶展现出疑似SMV花叶症状;RT-PCR方法在植株体内检测到了 SMV CP基因(1058 bp);DAS-ELISA方法检测到植株表现为SMV阳性(OD405nm>2.0)。将感病本氏烟植株(接种SMV分离物SC7-S9和SC7-S10)的叶片分别回接至南农1138-2。接种2周后,南农1138-2的叶片上出现了典型的SMV花叶症状,RT-PCR和DAS-ELISA方法对回接后的南农1138-2植株进行检测,结果均证实了 SMV的存在。对RT-PCR产物分别进行纯化回收并测序。结果表明,所测SMV(包括SC7-S9和SC7-S10)CP基因的核苷酸序列完全相同并且长度为795 nt。将上述序列在NCBI进行BLAST比对,结果显示其与SMV株系G3 CP基因的序列同源性达到了 97%。综上说明,SMV分离物SC7-S9和SC7-S10可以通过人工接种的方式侵染本氏烟,为应用转基因本氏烟验证SMV抗病候选基因的功能提供了理论依据。
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