目的:观察慢性睡眠剥夺对8月龄APPswe/PS1d E9（APP/PS1）双转基因阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）模型小鼠短期工作记忆、条件恐惧记忆、空间学习记忆能力和突触可塑性的影响,并探讨慢性睡眠剥夺（chronic sleep deprivation,chronic SD）加重AD病程中认知损伤可能的分子和病理机制。方法:1.动物分组及处理随机将8月龄雄性APP/PS1和其同窝野生型（wild type,WT）对照C57BL/6J小鼠分为4组:WT平台对照组（WT-PC）、WT睡眠剥夺组（WT-SD）、APP/PS1平台对照组（APP/PS1-PC）和APP/PS1睡眠剥夺组（APP/PS1-SD）,每组10-12只小鼠。采用改良多平台法对APP/PS1和WT小鼠进行连续21天的慢性睡眠剥夺。每天从中午12:00到次日上午08:00进行20 h睡眠剥夺（sleep deprivation,SD）或平台对照（platform control,PC）,次日上午08:00到中午12:00将所有小鼠放回笼内休息4 h。21天后开始行为学实验。2.Y迷宫自发交替实验将小鼠放入实验室适应24 h后开始实验。将每只小鼠依次放入迷宫的三角形中心区域后任小鼠在迷宫中自由探索8 min,需记录小鼠8 min内在迷宫内的运动轨迹、总进臂次数和进臂顺序,并且计算每只小鼠的自发交替正确率。3.Morris水迷宫实验此实验共分为三部分:定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验。定位航行实验是第1-5天,在此期间每只小鼠每天学习4次,将小鼠从四个象限分别投入水中,计时60 s,若小鼠在60 s内找到平台并在平台上停留5 s则视为成功登台。若小鼠在60 s内未找到平台,则需实验人员将小鼠诱导上平台。定位航行实验需记录每只小鼠的运动轨迹、找到平台的时间（逃避潜伏期）和游泳速度。定位航行实验后开始空间探索实验（实验第6天）,每只小鼠检测2次。将小鼠从除目标象限以外的两个象限投入水中,任小鼠在迷宫中游60 s,记录小鼠的游泳轨迹、游泳速度、穿台次数和目标象限游泳时间,并计算小鼠在目标象限的游泳时间百分比。空间探索实验结束后进行可视平台实验,每只小鼠检测2次。将小鼠从除目标象限以外的两个象限投入水中,记录小鼠的游泳轨迹、游泳速度和到达可视平台的时间。4.条件恐惧实验此实验包括训练阶段和检测阶段两部分。实验第一天是训练阶段,在训练阶段,先将小鼠放入恐惧惊跳箱适应90 s,期间小鼠可自由探索活动（自由探索期）,自由探索期后立即给予小鼠30 s的声音刺激（90 dB,2900 HZ）,声音刺激的最后2 s给与小鼠2 s的电刺激（0.3 m A）。声音刺激加电刺激为联合刺激。联合刺激共5次,每次间隔90 s。记录训练时期小鼠在自由探索期和声波刺激期的僵直比率。训练阶段完成后24 h进入检测阶段。将将小鼠放入内壁颜色不同的恐惧惊跳箱中自由探索150 s,期间小鼠可自由探索活动。150 s的自由探索结束后,再给予150 s的声音刺激（声波频率和强度与训练阶段相同,无电刺激）,即条件刺激（conditioning stimulus,CS）,在此期间记录小鼠在条件刺激前和CS的僵直比率。5.在体海马电生理记录小鼠被麻醉（5%水合氯醛,0.007 ml/g,i.p.）后将其头部水平固定在脑立体定位仪上,打开颅骨后将捆绑好的刺激电极和记录电极缓慢下到小鼠海马脑区（Schaffer侧枝-CA1区突触传递通路）,即可看到场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,f EPSP）。此时先通过给予逐渐增强的电流强度绘制出输入输出曲线（input-output curve,I/O curve）后再选择50%的最大刺激强度诱发并记录30 min稳定的f EPSP,即Basic。然后给予小鼠配对脉冲刺激,并记录小鼠的双脉冲易化（paired-pulse facilitation,PPF）。最后再给予高频刺激（high frequency stimulation,HFS）以诱导小鼠海马区的长时程增强（long-term potentiation,LTP）并连续记录60 min。6.Western blot实验电生理实验完成后,从各组随机选取小鼠进行Western blot实验。将小鼠麻醉（5%水合氯醛,0.007 ml/g,i.p.）后PBS灌注取小鼠脑组织并分离出双侧海马组织。将海马组织研磨并提取出蛋白后,测总蛋白浓度,选择上样量并上样跑电泳。待蛋白跑开后转到膜上,用5%脱脂牛奶室温封闭2 h后4°C孵育一抗（SYP和PSD-95）过夜,第二天TBST洗膜3次后室温孵育二抗2 h,再次洗膜3次。用ECL发光液曝光蛋白再用软件分析出小鼠海马组织中SYP和PSD-95的表达量。7.石蜡切片免疫组织化学实验电生理实验结束后,每组随机选取小鼠进行石蜡切片免疫组织化学实验。将小鼠麻醉（5%水合氯醛,0.007 ml/g,i.p.）后PBS灌注,用4%的多聚甲醛固定后梯度脱水。将脑组织包埋成蜡块,切片（2μm）。经过二甲苯脱蜡、梯度脱水、抗原修复后4°C孵育一抗（6E10或Iba-1）过夜。次日室温孵育二抗2 h后用DAB显色（2 min左右）。苏木素常温染色后PBS洗片3次,梯度酒精脱水、二甲苯透明后用中性树脂封片。在显微镜下观察各组小鼠海马组织6E10和Iab-1免疫阳性染色的面积并拍照后用软件进行分析。结果:1.慢性睡眠剥夺加重APP/PS1小鼠的短期工作记忆损伤。在Y迷宫实验中,与WT-PC组相比,APP/PS1-PC组小鼠的自发交替正确率明显降低（P<0.001）,表明APP/PS1小鼠的短期工作记忆受损,慢性睡眠剥夺后,APP/PS1小鼠的自发交替正确率进一步降低（P=0.002）,表明慢性睡眠剥夺加重了APP/PS1小鼠的短期工作记忆损伤。同时,代表小鼠的运动能力的总进臂次数在各组小鼠间无差别,表明运动能力对各组小鼠的自发交替正确率没有影响。2.慢性睡眠剥夺加重APP/PS1小鼠的空间参考记忆损伤。在水迷宫中的定位航行阶段,相较于WT-PC组小鼠,APP/PS1-PC组小鼠的逃避潜伏期明显更长（day3:P=0.024;day4:P=0.005;day5:P<0.001）,表明APP/PS1小鼠的长时程空间学习能力受损。经过慢性睡眠剥夺后,APP/PS1小鼠的逃避潜伏期下降了（day3:P<0.001;day4:P=0.027;day5:P=0.034）。空间探索实验中,WT-PC组小鼠比APP/PS1-PC组小鼠在目标象限中的游泳时间百分比（P=0.001）和穿台次数（P=0.044）更高,表明APP/PS1-PC的长时程空间学习能力受损。慢性睡眠剥夺后APP/PS1小鼠在目标象限中的游泳时间百分比（P=0.002）和穿台次数（P=0.044）进一步降低。以上结果表明慢性睡眠加重了APP/PS1小鼠的长时程空间学习能力损伤。在可视平台实验中,小鼠到达可视平台的时间没有明显差异,表明小鼠的视力和运动能力对实验结果没有影响。3.慢性睡眠剥夺加重APP/PS1小鼠的条件恐惧记忆损伤。在训练阶段联合刺激结束后的Pre-END期,APP/PS1-PC组小鼠的僵直比率明显低于WT-PC组（P<0.001）,且慢性睡眠剥夺会导致APP/PS1小鼠的僵直比率进一步降低（P=0.018）。在测试阶段的CS期,APP/PS1-PC组小鼠的僵直比率同样低于WT-PC组（P<0.001）,且APP/PS1-SD组小鼠的僵直比率进一步降低（P=0.025）,表明APP/PS1小鼠的恐惧记忆受损,慢性睡眠剥夺加重了这种损伤。4.慢性睡眠剥夺加重APP/PS1小鼠的在体海马LTP压抑。四组小鼠海马区在体场电位实验中的输入-输出（I/O）曲线都随着刺激电流强度的增加而增加,且相同刺激强度引起的f EPSP无明显差别,表明四组小鼠基础突触传递能力均正常。随后,四组小鼠均记录到30 min稳定的f EPSP,在此基础上给予小鼠HFS,除APP/PS1-SD组小鼠外,其它三组均成功诱导出LTP。HFS后60 min,APP/PS1-PC组小鼠的f EPSP斜率明显低于WT-PC组（P=0.023）,同时,在HFS后0 min和30 min,APP/PS1-SD组小鼠的f EPSP斜率明显低于APP/PS1-PC组小鼠（0 min:P<0.001,30 min:P=0.003）。以上结果表明,相对于WT小鼠,APP/PS1小鼠的在体海马LTP受到压抑;慢性睡眠剥夺进一步加剧了APP/PS1小鼠的海马突触可塑性损伤。同时,四组小鼠的PPF值（f EPSP2/f EPSP1）无显著性差异（P>0.05）,说明APP/PS1基因突变和慢性睡眠剥夺均未影响突触前神经递质的释放。5.慢性睡眠剥夺降低APP/PS1小鼠海马组织的PSD-95表达水平。SYP在WT-PC组小鼠的表达水平显著高于APP/PS1-PC组小鼠（P<0.001）,同时,PSD-95在WT-PC组小鼠的表达水平也显著高于APP/PS1-PC组小鼠（P<0.001）。慢性睡眠剥夺后,APP/PS1小鼠海马组织的PSD-95表达水平进一步降低（P<0.001）,但是SYP的表达水平未受影响。6.慢性睡眠剥夺增加了APP/PS1小鼠海马组织的Aβ斑块沉积和小胶质细胞激活。APP/PS1-PC组小鼠的海马有明显的Aβ斑块沉积,慢性睡眠剥夺后APP/PS1小鼠海马组织Aβ斑块沉积进一步增加（P<0.001）。同时,APP/PS1-PC组小鼠海马区Iba-1阳性面积百分比明显高于WT-PC组（P<0.001）,慢性睡眠剥夺后,APP/PS1小鼠海马区Iba-1阳性面积百分比进一步增加（P<0.001）。结论:慢性睡眠剥夺加重了APP/PS1小鼠海马区病理特征Aβ斑块沉积和小胶质细胞激活,加重海马LTP的抑制,降低了海马区PSD-95的表达,从而导致APP/PS1小鼠的短期工作记忆、长时程空间参考记忆和恐惧记忆等多种类型的认知损伤加重。