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海藻糖是一种非还原性二糖;是通过1,1糖苷键连接两个吡喃型葡萄糖单体所构成的;化学名称为α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷（α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside）,被称为生命之糖。海藻糖的化学性质很稳定,在生物体内具有抗脱水功能,因此生物在干旱、寒冷、高盐碱等胁迫条件下,海藻糖能够保护生物膜以及蛋白质等减少伤害,对生物体具有非常好的非特异性保护作用。由于海藻糖的制备工艺比较复杂,生产成本高,因此海藻糖的市场应用受到一定的阻碍。本实验以蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus的β-淀粉酶和海藻糖合酶为出发点,通过替换海藻糖合酶生产菌以及改变融合酶的连接方式,构建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶,并对融合酶的一些酶学性质进行初步的探索。本研究内容主要包括以下几方面:（1）β-淀粉酶与不同来源的海藻糖合酶双功能融合酶的构建与表达:通过PCR分别克隆了来源于菌种Pseudomonas stutzeri、Thermobaculum terrenum、Pseudomonas putide P06的海藻糖合酶基因,并且通过连接肽（EAAAK）3构建了β-淀粉酶和海藻糖融合酶菌株E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Ps）,E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Tt）,E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Pp）。重组菌株诱导表达后,通过SDS-PAGE对融合蛋白验证显示,3种融合蛋白均已表达。在催化6%直链淀粉中,3株重组融合酶都表现出了双功能活性,这三种融合酶45℃与6%直链淀粉反应12h后,融合酶转化率分别为26.587%,23.473%,23.7654%。经过酶学性质的测定,这3种融合酶最适反应温度均为45℃;最适p H分别为6.5、7.5、7.5;EDTA和Co2+对融合蛋白酶有抑制作用,Mn2+,Ca2+对融合蛋白酶酶活没有明显影响。（2）利用抗蛋白酶降解连接肽构建β-淀粉酶-海藻糖合酶双功能融合酶:本实验设计连接肽（PT）8P,以pET-28a-bap1ts Ps为质粒,利用限制性内切酶NotⅠ和HindⅢ,通过T4连接酶连接的方式将连接肽插入到β-淀粉酶与海藻糖合酶之间,构建β-淀粉酶和海藻糖合酶融合酶菌株E.coli BL21（pET-28a-bap4ts Ps）,SDS-PAGE显示,融合蛋白已表达。该融合酶的最适反应条件为:温度45℃,p H 6.5,在此条件下催化6%直链淀粉12h的转化率为86%,通过CDNN软件对圆二色光谱数据进行的分析显示,替换连接肽的融合酶与原始融合酶E.coli BL21（pET-28a-bap3ts Ps）相比,其空间结构并没有发生明显变化,但与单酶β-淀粉酶和海藻糖合酶相比,两种融合酶在反向平行构像上发生了明显变化。（3）利用插入融合构建β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶:通过无缝克隆的方式将海藻糖合酶基因插入到β-淀粉酶基因第446位氨基酸之后即苏氨酸与脯氨酸之间,构建β-淀粉酶和海藻糖合酶融合酶,并且在大肠杆菌中得到了表达。在发酵培养基（M9-ZJ-LM）诱导表达后,尽管SDS-PAGE显示融合蛋白已表达,但是融合酶仅表现出了β-淀粉酶活性,而海藻糖合酶并没有酶活。