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猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以造成新生仔猪神经系统疾病和呼吸系统紊乱及怀孕母猪的繁殖障碍为主要症状的传染性疾病。疫苗免疫曾经有效地控制了此病的流行和危害,但近年来,许多免疫猪群暴发伪狂犬病,并造成了严重的经济损失。本实验室于2012年在江苏某免疫猪场发病死亡的仔猪脑组织中分离到一株PRV JS-2012,经全基因组序列分析和感染试验证明该PRV发生了较大变异(Ye et al.,2015),对各年龄的猪致病力明显增强(Tong et al.,2015),而且现有的疫苗不能提供完全保护。本试验试图通过分析PRV JS-2012感染PK-15细胞后引起的细胞和病毒microRNA(mi RNA)表达谱变化,为进一步研究miRNA转录后对PRV复制、免疫及持续感染的调控作用奠定基础。通过sRNA文库构建、高通量测序,我们在PRV感染和未感染PK-15细胞的样品中分别得到109,595,539和112,037,904条高质量的小RNAs(sRNA)。利用生物信息学软件分析,在PRV JS-2012感染的PK-15细胞样品中初步检测到了36条mi RNA,其中11条为数据库中得到验证的高表达的保守的miRNA,其余25条可能是新的病毒miRNA(vmiRNA);除prv-miR-1、6、16、21和25外,其余20条vmiRNA均通过stem-loop RT-qPCR方法得到证实。与α-疱疹病毒miRNA通常编码在潜伏转录相关因子(LLT)区不同的是,PRV JS-2012编码的vmiRNA中只有3条(prv-miR-11-5p、prv-miR-12a-3p和prv-miR-17a-5p)分布在LLT区,其余至少17条则像β-疱疹病毒一样散在分布于PRV整个基因组,这在α-疱疹病毒中是首次发现。这些可能的新的mi RNA中,prv-mi R-LLT10a/b-3p、prv-miR-LLT11a/b-5p、prv-miR-12a/b-3p、prv-miR-13a/b-5p、prv-miR-14a/b-5p和prv-miR-17a/b-5p位于内部重复序列(IRS)和末端重复序列(TRS),而prv-miR-18至25、prv-miR-12 b、prv-miR-13 b、prv-miR-14 b和prv-miR-17由PRV基因组的负链编码。生物信息学预测,这些vmiRNA能调控包括参与病毒裂解复制和潜伏感染的相关基因。双荧光素酶表达系统验证结果表明分布在LLT区的prv-miR-LLT1、prv-miR-LLT7和prv-miR-LLT9对PRV转录极早期基因IE180表达有抑制作用,prv-mi R-LLT7对参与病毒复制调控的UL48基因(VP16蛋白)表达有抑制作用,因此这些vmiRNA可能在病毒感染过程中调节病毒的复制,而进一步功能试验表明体外过表达这些vmiRNA的模拟物,进而感染PRV后并未明显抑制IE180和VP16的蛋白表达水平。病毒感染细胞后还能通过影响宿主miRNA表达谱进而有利于病毒的复制。通过对PRV JS-2012感染组和未感染组的sRNA测序结果进行比较,分别在感染和未感染的sRNA文库中确认了303条和295条已知的猪源细胞miRNA,283条已知的和239条新的宿主miRNA在两个sRNA文库中是共有。感染的样品中有8条宿主miRNA显著上调,5条宿主miRNA显著下调。通过GO富集分析,这些异常表达的宿主miRNA的靶基因主要参与新陈代谢通路调控、生物过程的调节和先天性免疫等过程。通过合成这些宿主差异miRNA的模拟物或抑制剂,并将其在PK-15细胞中过表达,感染病毒后并没有发现这些宿主差异的miRNA对病毒的复制有显著影响。新出现的伪狂犬病毒显然能突破现有疫苗的免疫防线,使得免疫的猪群发病。为研究PRV JS-2012抗原性变异情况,本研究制备了JS-2012、SC(经典伪狂犬病强毒)和Bartha-K61(基因缺失弱毒疫苗株)的全病毒兔源和鼠源多克隆抗体。交叉中和试验显示Bartha-K61的全病毒多抗不能很好的中和JS-2012病毒,初步推断JS-2012变异株的抗原性可能发生了改变。此外,我们利用Bartha-K61和Bucharest疫苗免疫仔猪。利用制备的疫苗多抗与JS-2012、SC、Bartha-K61和Bucharest病毒进行交叉中和试验。两种疫苗均在免疫14 d后出现中和抗体,并且两个疫苗均是针对自身疫苗毒株中和效价最高,针对JS-2012的中和效价最低。该结果进一步说明了JS-2012的抗原性发生了变化。本研究为进一步鉴定PRV流行毒株的抗原变异奠定基础。综上所述,本研究首次分析了变异PRV JS-2012感染PK-15细胞后miRNA表达谱情况,分析了JS-2012的vmiRNA的保守性并鉴定了多条新的vmi RNA,并对其功能做了初步的验证。此外,本文鉴定了变异PRV感染PK-15细胞后对的宿主miRNA产生的影响,加深了对病毒感染细胞后的miRNA调控的理解和认识。同时为研究流行的变异PRV毒株的抗原性差异奠定基础。