我们实验室以前建立的小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞系,经过不同时期不同方法(形态、免疫组化、表达基因组芯片)的不断验证[李存玺、zhou shixin],确立了其为DC细胞的起源。利用其不同转移能力的克隆找到了在高转移亚系中高表达的一系列基因。其中包含VAP-33。我们还利用DCS细胞制备了兔多抗,经纯化后得到了DCS细胞特异的抗体。90年代我们实验室用自制的DCS多克隆抗体,通过Western Blotting方法鉴定出该抗体针对DCS细胞全蛋白在分子量为32kDa左右处有一特异性条带,并且电镜结果显示该蛋白表达在细胞膜上;本论文进一步提取DCS细胞膜蛋白,利用该抗体进行IP,从沉淀蛋白所跑SDS-PAGE胶上,切取32kDa左右的蛋白条带进行质谱分析,所得肽段蛋白序列输入NCBI Blast,与其序列匹配度最高的为VAP-33。由此,深入开展了VAP-33在DC及DCS细胞中的表达和功能研究,以期明确其在肿瘤侵袭转移中的作用。本论文分为两部分。第一部分中,重点观察VAP-33在DCS细胞及DC细胞中的表达及功能。首先,我们用免疫组化、Western blotting等方法对DC细胞及DCS细胞中VAP-33的表达进行了研究。最初我们提取DCS细胞的膜蛋白采用质谱技术检测到DCS细胞膜蛋白中有VAP-33的表达;又利用免疫组化的方法再次证实DC细胞及DCS细胞表达VAP-33;Western blotting结果显示VAP-33在DCS细胞不同肺转移能力的克隆细胞株(DD1＞DCS＞DG6)中也有表达,并随肺转移能力的不同而不同,在肺高转移的DD1细胞中VAP-33表达最高。其次,为了进一步验证VAP-33在肿瘤侵袭转移及肿瘤细胞体外成瘤能力中的作用,我们通过Tanswell、克隆形成率等方法,研究经VAP-33单抗封闭48h后的DCS细胞在穿膜能力、克隆形成能力方面的变化。Tanswell方法观察到,VAP-33抗体封闭后的穿膜细胞较空白组及同型对照组都少(p＜0.01),说明VAP-33与细胞侵袭转移能力有关系;克隆形成率检测该蛋白与细胞体外成瘤能力没有明显关系(p＞0.05),说明VAP-33与细胞的增殖无关。由于DCS细胞来源于DC细胞,而DC细胞又是重要的抗原递呈细胞,因此,除了上述对VAP-33与肿瘤侵袭转移关系的研究,我们还对大分子抗原刺激后的DCS细胞在形态、功能改变等方面进行了研究,其中特别关注了VAP-33的表达变化。倒置显微镜下观察到随抗原剂量的增加,细胞分支增多变长,细胞更铺展,趋向成熟DC的形态;Western blotting结果显示VAP-33的表达随抗原量的增加及抗原刺激时间的延长而降低;共聚焦显微镜观察到VAP-33在细胞胞浆中的表达更加分散、均匀。我们预期的结果是随抗原量的增加或抗原刺激时间的延长,VAP-33的表达会随之增加或者发生分布上的变化,与实际结果存在偏差。有研究显示,在胞浆中VAP-33与再循环内体(recycling endosomes,REs)的标志分子TfR(transferrinreceptor)有共定位,因此我们认为,DCS细胞在受到抗原刺激时,VAP-33通过再循环内体从核周的质膜不断地循环往复协助处理抗原。由此我们推断在该过程中VAP-33被消耗,或者消耗大于合成的速度,VAP-33有可能参与抗原处理。许多文献中报道了VAP-33参与GLUT-4囊泡转运,因此,我们也对两者在肿瘤细胞中的关系进行了初步探讨。血清饥饿后的DCS细胞经胰岛素刺激后,细胞膜中VAP-33及GLUT-4的分布发生变化。Western blotting检测结果显示两种蛋白量的变化不明显,而共聚焦显微镜结果显示细胞膜上VAP-33和GLUT-4共表达增加。这一结果需进一步利用强迫过表达VAP-33的实验体系进行重复验证。因此我们开展了下一部分的工作。第二部分中,为了更好的研究VAP-33在肿瘤侵袭转移中的作用,我们构建了表达VAP-33 CFP融合蛋白的表达载体。根据Gene Bank中VAP-33的mRNA序列(从起始密码子到终止密码子的前一个密码子,长726bp)设计一对引物,在正反引物的5’端分别加入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细胞的cDNA中扩增VAP-33,利用基因重组技术,将VAP-33的目的基因克隆到pECFP-N1载体的XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点之间,构建重组载体,经测序该载体构建成功。为后续实验奠定了基础。