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本研究论文分为两部分:一、单胺类抗抑郁药物预防水禁拘束应激和吲哚美辛诱发胃黏膜损伤的共同机制;二、N-乙酰天门冬氨酸在急慢性应激中的作用及机制研究。一、单胺类抗抑郁药物预防水禁拘束应激和吲哚美辛诱发胃黏膜损伤的共同机制胃溃疡是一种消化道常见、多发又极易复发的疾病,目前临床使用的治疗药物包括胃酸分泌抑制剂(如奥美拉唑)、抗酸药(如氢氧化铝)、黏膜保护剂(如果胶铋)与抗幽门螺旋杆菌(抗生素类)药物。治疗胃溃疡的研究靶点越来越广泛,不再局限于传统药物途径,作用于中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的药物可能成为治疗胃溃疡的新方向。多种单胺类抗抑郁药对实验性胃溃疡有预防作用。既往研究发现多种单胺类抗抑郁药包括选择性5-羟色胺去甲肾上腺素再摄取抑制剂(selective serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor,SNRIs)、三环类药物(Tricyclic agent,TCAs)、单胺氧化酶抑制剂(Monoamine oxidase inhibitor,MAOs)和选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRIs),预防性给予均能够减轻多种因素如应激、非甾体抗炎药等造成的胃黏膜损伤,减少溃疡点。而氧化还原反应的失衡在消化道黏膜损伤的发生中发挥重要作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是胃肠道内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)最重要的来源之一。本课题从氧化应激角度出发,从SNRIs的代表性药物盐酸度洛西汀入手,选用水浸拘束应激(Water immersion restraint,WIRS)和吲哚美辛(Indomethacin)诱导的大鼠胃黏膜损伤模型,研究胃黏膜的NADPH氧化酶在其中发挥的作用,并将其延伸到TCAs(阿米替林)、MAOs(吗氯贝胺)和SSRIs(氟西汀)药物,探讨单胺类抗抑郁药对胃溃疡预防保护作用的共同分子机制。研究发现,盐酸度洛西汀所发挥的胃黏膜保护作用与减轻脂质和蛋白质的氧化应激有关,但不影响抗氧化能力,在整个胃黏膜损伤过程中并不影响DNA的氧化损伤。同时,盐酸度洛西汀可抑制胃黏膜NADPH氧化酶活性,并且NADPH氧化酶抑制剂apocynin可以剂量依赖性地保护胃黏膜。此外,NADPH氧化酶的两种亚型DUOX2和NOX4参与了盐酸度洛西汀在两种模型中的保护作用。进一步研究发现,阿米替林、氟西汀、吗氯贝胺这三种抗抑郁药物均降低胃黏膜中DUOX2的表达。因此,单胺类抗抑郁药对WIRS和吲哚美辛所致胃溃疡大鼠的中均下调胃黏膜中DUOX2的表达,可能因此减少氧化应激损伤,发挥预防保护作用。实验结果为单胺类抗抑郁药提供了一个外周作用分子靶点,揭示这类药物的作用机制不仅仅涉及单胺类的调节。二、N-乙酰天冬氨酸在急慢性应激中的作用及机制研究应激,不论是是物理因素(比如机械性刺激)、化学因素(如活性氧)、生物因素(如病原体、细菌、病毒、寄生虫)或社会环境因素(如生活压力大、战争、丧失亲人等)都会引起生理与心理方面的异常。应激状态影响全身代谢和内分泌,造成神经-内分泌系统失调。N-乙酰天冬氨酸(N-acetylaspartate,NAA)是一种在中枢神经系统内广泛存在的代谢物,在脑中的浓度可达到10 mM甚至更多,NAA由NAT8L基因编码的L-天冬氨酸-N-乙酰基转移酶(L-aspartate N-acetyltransferase,Asp-NAT)催化生成,经天冬氨酸酰基转移酶(Aspartoacylase,ASPA)代谢,在N-乙酰天冬氨酰谷氨酸合成酶I(N-acetylaspartylglutamate synthetase I,NAAGSI)的作用下与谷氨酸生成 N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(N-acetylaspartylglutamate,NAAG),NAAG被细胞膜上的谷氨酸竣肽酶Ⅱ(glutamate carboxypeptidase Ⅱ,GCPⅡ)和 GCPⅢ 水解代谢为NAA和谷氨酸。我们发现,抗抑郁药盐酸度洛西汀在减少急性应激引起的胃溃疡损伤的过程中,关键核团中央杏仁核(Central amygdala,CeA)内的NAA含量显著降低,溃疡指数和NAA的变化之间呈线性负相关。所以在特定脑区内通过干预酶的作用减少NAA的来源或者增加NAA的代谢可能产生抗应激作用。因此,我们探索了在急慢性应激情况下参与降低NAA含量的关键生成与代谢酶,通过对其干预确证其是否能够转换应激激活与治疗抵抗状态,并对其可能的作用机制进行探究。研究首先通过建立致胃溃疡的水浸拘束急性应激WIRS与致抑郁的慢性温和不可预见性应激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型、社会竞争失败(Social defeat,SD)模型,利用核磁共振波谱(Proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)技术,观察特定脑区NAA的含量变化及其与急、慢性应激反应程度之间可能的联系,检测应激前后NAA的含量变化。从抗抑郁药盐酸度洛西汀在减少急性应激引起的胃黏膜损伤的同时显著降低CeA内的NAA含量这一现象入手,进一步发现溃疡指数和NAA的变化之间呈线性负相关。敲低CeA中的NAA合成酶Nat8l,结果显示胃黏膜损伤程度因而减轻,而外源性注射NAA会加重胃黏膜损伤。且NAA不通过外周发挥减轻急性应激的作用。然后,我们建立了大鼠CUMS模型并根据糖水偏爱和强迫游泳实验的结果将其分为应激易感型与应激抵抗型,易感型比率为33%,小鼠SD模型的行为学评价实验为社交接触实验,易感型比率为61.9%。对应激易感动物给予选择性5-HT再摄取抑制剂氟西汀进行治疗,1H-MRS结果显示治疗有效组大鼠治疗前后CeA内的NAA变化量与治疗抵抗组之间具有显著性差异,而背外侧前额叶皮层(dorsolateral prefrontal cortex,dlPFC)区域则没有此现象,提示改变特定脑区NAA的含量可能转变动物对抗抑郁药氟西汀的治疗反应性。进而,我们在CeA内注射腺相关病毒敲低NAA合成酶Nat81,发现其逆转了应激抵抗动物的抑郁样行为,在行为学测定中表现为应激易感型,提示Nat81可能通过调节NAA含量改变动物的应激状态,结合急性应激结果,Nat81可能作为动物应激易感/抵抗的分子标志物。此外,蛋白免疫印迹结果显示,两种慢性应激模型下,应激抵抗动物dlPFC脑区内GCPⅢ的含量均显著低于对照组,应激易感动物dlPFC脑区GCPⅢ含量均显著高于应激抵抗动物,提示dlPFC脑区内GCPⅢ在调节动物对慢性应激反应性的过程中发挥重要作用。而GCPⅡ含量均降低,说明应激会导致NAAG向NAA的转化能力变低。并且,应激抵抗鼠NAAGSI的含量均显著低于对照,提示我们在应激状态下,机体为了维持自身行为稳定或保持正常生理状态,会反馈性调节相关代谢酶含量以维持NAAG的平衡,而靶向NAA的生成代谢酶可能会转换机体对起应激的反应状态,作为抗抑郁治疗的靶点。