急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)主要以增加的炎症反应和肾脏固有细胞的破坏为特征,进而造成肾脏功能的急剧紊乱。正常肾脏组织中肾小管上皮细胞形态完好且排列整齐,而损伤的肾脏组织肾小管上皮细胞形态不规则,脱落,细胞核皱缩。病理特征包括巨噬细胞的募集浸润,炎症因子的释放,以及肾脏固有细胞死亡和增殖的延迟。缺血再灌注,肾毒性药物以及败血症等多种病因均可引起急性肾损伤,然而急性肾损伤的具体机制和有效的治疗手段有待进一步探究。在急性肾损伤中,细胞会发生凋亡、坏死或者自噬等细胞死亡。而最近研究报道,程序性坏死,而非凋亡,在急性肾损伤中扮演着重要的角色,并触发严重的炎症反应。细胞经历程序性坏死不仅具有坏死样的结构特征,还可以被死亡信号通路调控。目前RIPK1/RIPK3/MLKL链被广泛认为是程序性坏死中主要的调节物。目前,对于急性肾损伤尚无有效的治疗措施。鉴于传统中药显著的药理作用和相对较低的毒性,已经被用来治疗多种疾病。课题组筛选了汉黄芩素等十种以上具有抗炎活性成分的中药,以探究对顺铂引起的急性肾损伤是否具有保护作用。其中预实验结果发现汉黄芩素对顺铂引起的急性肾损伤保护作用最好。已有充分文献和研究表明,汉黄芩素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤增殖等作用。为了研究汉黄芩素对急性肾损伤的治疗作用及保护机制,实验分为以下几个部分。1.探讨汉黄芩素腹腔注射给药对急性肾损伤小鼠的保护作用。将雄性6-8周的C57BL/6小鼠随机分为正常组,模型组和汉黄芩素组(12.5,25,50mg/kg),每组8只小鼠。模型组和给药组小鼠通过皮下腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型,同时给药组以每天12.5,25和50 mg/kg腹腔注射汉黄芩素,正常组注射等体积生理盐水作为对照,三天后将小鼠麻醉牺牲,取血取肾。为了观察汉黄芩素对急性肾损伤的保护作用,用PAS染色检查肾组织的病理学损伤,肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)试剂盒检测血清中Cre和BUN的含量,用Western blot和RT-PCR检测肾脏损伤分子KIM-1表达,同时通过免疫组化检测巨噬细胞表明标记物F4/80+以及通过RT-PCR检测炎症因子的表达情况。PAS染色和评分表明,和模型组相比,每天注射12.5,25和50mg/kg的汉黄芩素可明显减轻小鼠肾小管坏死和扩张,用药组小鼠血清肌酐和尿素氮含量均明显下降,同时汉黄芩素明显降低顺铂诱导的肾脏损伤分子KIM-1在蛋白和mRNA水平的表达。通过组织F4/80染色,可以表明汉黄芩素可减少巨噬细胞的浸润数目,同时它能抑制顺铂激活的NF-κB通路和TNF-α表达,以及IL-1β、IL-6等炎症因子的释放。电镜结果进一步验证汉黄芩素能明显改善顺铂引起的细胞核结构破坏和细胞内细胞器异常。以上结果提示汉黄芩素在体内对顺铂诱导的急性肾损伤有一定的治疗作用,可抑制急性肾损伤伴随的炎症反应。2.探讨汉黄芩素体外给药对顺铂诱导的HK2细胞损伤的保护作用。首先用MTT法检测不同浓度的汉黄芩素(0,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40μg/ml)对HK2细胞生存率的影响,结果表明当浓度低于2.5μg/ml时,汉黄芩素不具有细胞毒性。将细胞加顺铂刺激和药物同时孵育,再通过MTT和LDH法检测,结果表明汉黄芩素可改善顺铂对HK2细胞生存的抑制作用,且药效呈剂量依赖性,进而接下来的实验汉黄芩素均采用2.5μg/ml的浓度。值得一提的是,顺铂作为临床上常用的抗肿瘤药,通过MTT检测三种不同肿瘤细胞的活性,结果表明汉黄芩素不仅不影响顺铂的抗肿瘤作用,甚至还增强顺铂对HepG2细胞的抗增殖能力,所以,在顺铂治疗肿瘤患者时,汉黄芩素可有效地作为急性肾损伤的肾脏保护辅佐剂。体外通过顺铂刺激HK2细胞建立急性肾损伤模型,电镜图像表明汉黄芩素可抑制顺铂诱导的细胞核肿胀和细胞器缺失。细胞凋亡流式图和PI/AnnexinV免疫荧光结果显示顺铂可同时引起HK2细胞发生凋亡和坏死,而汉黄芩素能分别降低早期凋亡和晚期凋亡及坏死的细胞数。通过Western blot和免疫荧光检测KIM-1表达变化,结果表明汉黄芩素能有效减轻顺铂刺激的KIM-1表达。通过免疫荧光检测TNF-α蛋白水平,RT-PCR检测TNF-α和IL-1β等炎症因子mRNA水平,结果表明汉黄芩素很大程度地抑制顺铂引起的炎症因子的释放和表达。ELISA检测IL-6和IL-8进一步证明汉黄芩素对急性肾损伤的保护作用。3.探讨体内外急性肾损伤模型中,汉黄芩素对顺铂诱导的细胞程序性坏死中关键蛋白的影响并通过分子对接技术预测汉黄芩素和RIPK1之间相互关系。在体内外模型中,通过Western blot检测不同组别RIPK1,RIPK3和p-MLKL的表达,结果均表明汉黄芩素能有效抑制顺铂诱导的RIPK1,RIPK3和p-MLKL的表达。通过分子对接技术,表明汉黄芩素是一种理想的RIPK1抑制剂,因为它可占据RIPK1酶的ATP结合口袋,从而抑制了RIPK1的活性,进而表明汉黄芩素可能是靶向于RIPK1调控的细胞程序性坏死改善顺铂诱导的急性肾损伤。鉴于急性肾损伤中细胞会发生凋亡,为了更加全面了解汉黄芩素的保护机制,同时检测了急性肾损伤中凋亡蛋白的指标,结果表明,汉黄芩素只能轻微地抑制顺铂诱导的Cleaved-Caspase3/8的表达,而对程序性坏死通路中的蛋白明显抑制。4.通过干扰RIPK1和RIPK3进一步探讨汉黄芩素对急性肾损伤的保护机制。为了进一步证明汉黄芩素在顺铂引起的急性肾损伤中对RIPK1/RIPK3的抑制作用,分别阻断RIPK1和沉默RIPK3探究其保护作用是否受影响。结果表明,与汉黄芩素治疗组相比,RIPK1抑制剂Nec-1的使用进一步降低RIPK1/RIPK3/pMLKL的表达,同时抑制顺铂引起的KIM-1,TNF-α和IL-6表达水平。然而,当RIPK1被抑制后,汉黄芩素不能进一步下调KIM-1和IL-6的表达,暗示汉黄芩素的功能可能是通过RIPK1。另外,通过转染RIPK3 shRNA沉默RIPK3表达,结果显示沉默RIPK3后能降低RIPK3和p-MLKL的蛋白水平,不影响RIPK1的水平,RIPK3的沉默能明显降低顺铂引起的KIM-1,TNF-α和IL-6表达,而此时汉黄芩素不能进一步起到保护作用,以上实验结果更加验证了汉黄芩素的保护机制。综上,研究表明汉黄芩素通过靶向于RIPK1调控的程序性坏死改善顺铂诱导的急性肾损伤。而且,汉黄芩素在不同的肿瘤细胞中不影响甚至促进顺铂的抗肿瘤作用。所以,在顺铂治疗肿瘤患者时,汉黄芩素可有效地作为急性肾损伤的肾脏保护辅佐剂。