传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)引起的急性、高度接触性传染病。由于IBV的易变性,不同地区、不同时期流行的IBV毒株差异很大。自1996年QX型IBV在我国首次分离以来,即表现出较强的传播能力,在许多国家和地区流行,目前已成为我国IBV流行株的优势基因型。由于不同类型IBV毒株之间只有部分或完全没有交叉保护作用,而我国目前广泛使用的Mass型疫苗与QX型毒株亲缘关系较远,这就导致疫苗免疫失败的情况时常发生,给养殖业带来巨大的经济损失。因此,研制与当前流行毒株抗原性一致的疫苗对于IB的防控显得尤为重要。本实验室前期曾对QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株进行了鸡胚连续传代致弱,并获得了免疫原性好、遗传性状稳定的弱毒疫苗株(QXL株)。在临床试验中,QXL株的安全性和免疫保护效果良好。本研究对QXL株的第5代、第40代、第60代、第80代和第100代毒株(QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-100)进行了全基因测序,并构建了QXL-5毒株的反向遗传系统,为了解QX型IBV CK/CH/JS/2010/12株鸡胚传代致弱的分子机制提供了依据。1.不同代次IBV CK/CH/JS/2010/12株的全基因序列测定与分析对IBV QXL-5、QXL-40、QXL-60、QXL-80、QXL-100的全基因进行分段克隆、测序,并通过生物学软件对各片段比对、拼接,获得各代次毒株的全基因序列。结果显示,QXL株基因组结构为5UTR-1a-1b-S-3a-3b-M-ORFX-5a-5b-N-UTR3’。其中QXL-5和QXL-40全长为27681bp, QXL-60、QXL-80和QXL-100全长为27682bp,其基因组在ORFX处多出一个碱基A。对各代次毒株的全基因序列分析发现,QXL-40、QXL-60基因序列变化较大,分别占碱基总变化数的28.21%和66.67%,而QXL-80、QXL-100基因序列与QXL-60相比,变化很少,趋于稳定。与前期动物试验结果保持一致。在传代过程中,QXL-40有44个碱基发生变化,并引起23个氨基酸变化；QXL-60在此基础上又有108个碱基发生变化,并引起31个氨基酸变化；QXL-80在前面148处变化的基础上又有2个碱基发生变化,引起2个氨基酸变化；QXL-100在前面150处变化的基础上又有6个碱基发生变化,并引起3个氨基酸变化。这些突变的氨基酸分散地存在于基因组的不同区域,其中nsp2变化最大,nsp3和S基因也发生了较大的变化。分析结果表明IBV的毒力强弱可能不是由单个氨基酸的突变引起的,而是由多个基因共同决定的；同时,其非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。2. IBVQXL-5株反向遗传平台的建立为了进一步研究IBV的变异机理,我们将QXL-5的全基因分成13段进行感染性克隆的构建。通过引物在其5’末端引入T7 RNA聚合酶启动子核心序列,3’末端加上polyA尾巴结构,并在ORF5引入一同义突变作为遗传标记。首先将各片段连入pEASY-Blunt载体中进行克隆、测序。然后各测序正确的片段经酶切、体外拼接获得基因组全长cDNA分子。同时获得N基因全长cDNA以提高病毒的拯救效率。最后经体外转录、共转染宿主细胞的方法获得具有感染性的病毒。转染后48h,将细胞反复冻融3次接种10日龄SPF鸡胚,并盲传数代。对亲本毒株QXL-5及盲传3代的病毒进行EID50的测定。结果显示两者的病毒滴度相似,分别为106.3EID50/0.1mL和106.0EID50/0.1mL。通过基因测序对引入的遗传标记进行鉴定。测序结果表明标记基因发生了变化,初步证明成功拯救出了具有感染性的QXL-5病毒,命名为rQXL-5。该反向遗传平台的建立为IBV致病机制和新型疫苗的研究奠定了基础。