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食管癌在我国是常见的消化道肿瘤之一,长期以来,我国食管癌死亡人数位居高不下。2017年2月国家癌症中心发布中国最新癌症数据,报告了2013年中国每天约1万人诊断癌症,每分钟约7人确诊患癌,食管癌在所有恶性肿瘤中以发病率27%左右,死亡率20%左右,居于第四的高位,仍是我国居民发病和死亡的主要负担。根据Global cancer statistics2012数据估计,全球因食管癌死亡人数为40.02万,其中中国食管癌死亡人数为19.75万,占全球死亡总数的49.35%。研究学者对食管癌病因进行了的科研,认为食管癌的发生是受多因素、多阶段、多基因影响的复杂过程,确切病因仍无定论,但除了遗传、生活行为方式、饮食习惯等因素外,生活环境也是影响食管癌发生的重要因素。近年,一些慢性感染也被认定为癌症的危险因素,由于幽门螺旋菌、人乳头瘤病毒(HPV)、爱泼斯坦-巴尔病毒3和乙型肝炎病毒等感染引起致癌性。最新的研究进展表明,肠道微生物菌群结构发生异常与糖尿病、冠心病、肥胖、高血压等代谢性疾病有着千丝万缕的关系。也有一些研究者,分析了肠道菌群失调与结直肠癌有着密切的关系,更有报道指出,消化道不正常的菌群结构会造成食管的持续性慢性炎症,会增加食管癌风险2-40倍,以及胃食管巴雷特症增加食管癌风险30-400倍。最重要的是人体的微生物与免疫系统有着密切关系,直接或间接参与肿瘤的发生与发展中的多种变化,甚至是对治疗效果也有着重要作用。本研究将利用基因测序技术和16S-rDNA的基因分类法,分析粪便排泄物和咽部分泌物中的微生物组成,探讨食管癌患者与其肠道以及咽部微生物结构的关系。目的:初步探索食管癌患者咽拭子和便标本微生物组构成情况。方法:分别提取食管癌患者和正常人的咽拭子和便标本微生物总DNA,分为食管癌咽拭子组(esophageal cancer pharynx swab group,ES)、食管癌便标本组(esophageal cancer faeces group,EF)、正常对照咽拭子组(normal control pharynx swab group,NCS)和正常对照便标本组(normal control faeces group,NCF),每组21例。提取DNA后进行16S-rDNA测序分析,通过llumina官方说明构建测序文库,Hiseq2500的PE250模式进行测序。经过去除N比例过高的序列,去除低质量序列,Tags拼接,Tags过滤,并最终去除Tags中的嵌合体序列得到有效数据(Effective Tags)。然后将Effective Tags进行丰度统计,接下来聚类成OTU(Operational Taxonomic Units),再进行各种分析,最终分析微生物组Alpha多样性、Beta多样性。建立物种注释,物种分类树,进行物种差异分析。结果:所有标本经过数据处理后得到的effective tags都符合后续分析要求。1.数据处理经数据过滤及Tags拼接,4组中每个样本平均序列数为54567.05±7841.034条,样本最终获得有效序列14289161条,最大序列数为75817条,最小序列数为39084条,总序列平均读长487bp。所得到的Effective Tags分别是ES组:55366.42±6154.67;EF组:53756.92±10952.46;NCS组:54827.00±7486.13;NCF组:53310.33±4480.43。有效率分别为:81.48±6.35%、84.62±1.90%、86.29±2.34%、85.34±0.42%。OTU分析可见食管癌患者咽部(ES组)菌群2170个OTU与正常人群(NCS组)菌群805个OTU有682个重复;食管癌患者粪便标本(EF组)菌群1993个OTU与正常人群(NCF组)菌群690个OTU有510个重复。2.物种分类分析物种注释和物种分类树可见各组样品的物种丰度和分布情况比较均匀。组内呈现明显的聚集,组间呈现明显差异。3.多样性分析Alpha多样性分析样本OTUs得到Chao1、Shannon指数显示EF组与NCF组之间,ES组与NCS组之间均呈现患者组略高于正常人群对照,但统计学差异均不显著(P>0.05)。稀释曲线(rarefaction curve)、shannon稀释曲线(shannon rarefaction curve)和Rank Abundance曲线说明测序深度基本覆盖到样品中所有的物种,测序深度、测序量趋于饱和,样品丰富度较高,样品中菌群分布均匀。箱线图显示各组样品有较好聚集。Beta多样性NMDS(Non-metric Multidimensional scaling)分析显示各组样本分开趋势明显,而每组样品各自呈现明显的聚集倾向,说明各组的菌群结构存在一定差异,同组样品间各自相似性明显。4.物种差异门水平上咽部共检测到21个门存在,其中4个有差异,分别为螺旋菌门Spirochaetae,软壁菌门Tenericutes,拟杆菌门Bacteroidetes,互养菌门Synergistetes。粪便标本共检测到17个门,其中5个有差异,分别为厚壁菌门Firmicutes,梭杆菌门Fusobacteria,变形菌门Proteobacteria,Saccharibacteria菌门,放线菌门Actinobacteria属水平上咽部检测到209个属,26个属存在差异,便标本共检测到241个属,23个属有差异。主要是拟杆菌属Bacteroides,普氏菌属Prevotella,罗氏菌属Rothia,链球菌属Streptococcus,产线菌属Filifactor,韦荣球菌属Veillonella,消化链球菌属Peptostre ptococcus,密螺旋体属Treponema,理研菌属Rikenellaceae等,还有一部分没有分类的菌属。结论:食管癌患者和正常人群咽部和便标本微生物菌群丰度差异不大,但是菌群结构的分布上存在较大差异。咽部26个属,便标本23个属都有差异,提示食管癌患者咽部和便标本微生物菌群结构有一定差异。