成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一,具有来源广泛、取材方便等特点,并且具有很强的体外分化和增殖能力,因此体外扩增培养成骨细胞是非常重要的。 本研究对来自Sprague-Dawley(SD)大鼠颅盖骨的细胞进行了原代和传代培养,并对其形态学及特异性等生物学性能进行了检测,确定所培养的细胞是成骨细胞,并通过纯化确保没有其他细胞的污染,可为后续的实验提供数量充足的骨组织工程种子细胞,也为实验的准确性和可重复性提供了保证。 利用旋转壁式生物反应器(Rotating wall vessel bioreactor,RWVB)具有剪切力低、培养的细胞之间有三维联系的机会以及醋酸纤维素中空纤维膜具有良好的生物相容性等优点,我们研制了一种新型的旋转壁式中空纤维膜生物反应器(Rotating Wall Hollow Fiber Membrane Bioreactor,RWHFMB),力求建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系。 利用中空纤维膜作为成骨细胞的载体,以1×10~5cells/ml接种密度在RWHFMB内对其进行大规模扩增,并在静态环境中以相同条件对照培养。每隔12h对细胞进行取样,培养5天后对细胞进行收获。对所扩增的细胞分别进行扫描电镜(SEM)观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、钙化结节染色等生物学性能检测,并对培养过程中的营养代谢情况进行分析。结果显示,在RWHFMB内动态培养的成骨细胞生长良好,分泌大量的细胞外基质:中空纤维膜亦表现出良好的生物相容性。实验结果证实RWHFMB能结合RWVB和中空纤维膜的优点,较好的模拟体内环境,对所培养的细胞施加适当的流体应力刺激,促进细胞的新陈代谢和物质交换,更有利于细胞的生长及增殖。 总之,本研究确定了在RWHFMB内扩增骨组织工程种子细胞的适宜工艺和操作参数,明确了这种新型反应器可以提供低剪切力的培养环境,而且细胞之间有三维联系的机会,成骨细胞表现出良好的体外扩增能力,适于建立一种理想的成骨细胞体外扩增的三维培养体系,并且中空纤维膜可以作为一种改进的载体用于骨组织工程种子细胞的大规模扩增。此外,RWHFMB内部流体对流所产生的应力刺激及其提供的三维培养环境,可提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性表达,从而完成成骨细胞的快速增殖与分化。