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目的HSP100/ClpATPase是一类高度保守而且广泛存在的热休克蛋白（heat shockprotein, HSP），属于AAA+（ATPase associated with diverse cellular activities）蛋白超家族，具有多种生物学功能。他们可以与蛋白酶ClpP结合形成ATP依赖的蛋白酶复合体促进特异的底物蛋白质的水解，而ClpATPase决定了ClpP的裂解功能和降解底物的特异性[3]。大量研究已证实ClpATPase在许多病原菌的致病过程中发挥了重要作用。在金黄色葡萄球菌，ClpX缺陷株的毒力显著降低，这种作用主要是通过调节主要毒力因子的表达来实现的[8]。在单核细胞增多性李斯特菌，ClpC通过调节侵袭相关毒力因子的表达参与细菌粘附侵袭宿主细胞的过程[10]。我们课题组前期对肺炎链球菌ClpE的研究发现：在小鼠腹腔感染模型clpE缺陷肺炎链球菌的致病能力明显降低。那么ClpE影响细菌致病的机制如何呢？即它是通过对哪些毒力因子的影响作用而调控细菌相应的毒力表现呢？要想弄清这些问题，就必须寻找到与ClpE有相互作用的特异性蛋白底物。本研究拟通过目前应用广泛的研究蛋白质相互作用的大肠杆菌双杂交系统和免疫共沉淀实验两种方法来筛选ClpE的相互作用蛋白，进一步进行相应的功能研究，初步揭示ClpE在肺炎链球菌中的作用机制。方法1.大肠杆菌双杂交系统筛选首先，是ClpE蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备。我们构建了含His标签的原核表达载体pET28a-ClpE，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导过夜表达后，采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白rClpE。进一步应用SDS-PAGE对表达和纯化产物进行分析后，透析除盐。纯化的rClpE抗原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔，制备rClpE多克隆抗体。其次，构建诱饵质粒pBT-ClpE，经PCR和测序证明载体构建成功后转化大肠杆菌双杂交系统菌株（编号200192）。IPTG诱导后采用Western blot验证ClpE的表达。同时共转化pBT-ClpE和pTRG至大肠杆菌双杂交系统菌株（编号200192），观察在NSSM、SSM平板上的生长情况，对其自激活作用进行检测，确定pBT-ClpE可以用于后续的筛选实验。再次，构建文库质粒pTRG-DNA片段。我们采用限制性内切酶Sau3AⅠ随机酶切肺炎链球菌基因组DNA后，与经过BamHⅠ酶切的质粒pTRG连接过夜，转化大肠杆菌双杂交系统菌株（编号240065）。从而最终得到含有不同大小DNA片段的文库混合质粒。最后，诱饵质粒pBT-ClpE和文库混合质粒共转化大肠杆菌双杂交系统菌株（编号200190），在选择性平板SSM上筛选阳性克隆。2.免疫共沉淀筛选构建含GFP标签的载体pAE03-ClpE，转入肺炎链球菌D39，形成菌株D39（ClpE：：GFP）。将GFP单克隆抗体，Protein G磁珠以及D39（ClpE：：GFP）裂解液或D39裂解液（对照）在4℃孵育过夜后，与ClpE有相互作用蛋白可能已结合于protein G。磁珠经过PBS洗5次后，SDS-PAGE检测，两组之间的差异条带即为ClpE的相互作用蛋白。切胶后送深圳华大基因进行质谱鉴定。3. ClpE对FtsW蛋白含量的影响研究在实验中我们发现ClpE缺陷菌的细菌形态与野生菌相比存在差异，成长杆状，无中间的凹陷。进一步电镜观察发现ClpE缺陷菌菌体要长于野生菌。推测ClpE可能参与调控细胞分裂。生物信息学分析显示，我们所筛选的ClpE相互作用蛋白FtsW与细胞分裂相关，因此我们对该蛋白进行了初步的功能研究：通过Westernblot观察热应激对FtsW表达的影响，通过β-半乳糖苷酶活性检测观察ClpE在FtsW降解中的作用。结果1.成功构建了ClpE原核表达载体pET28a-ClpE，获得了纯度大于85%的重组蛋白ClpE。纯化的rClpE抗原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔，获得了兔和鼠两种来源的rClpE多克隆抗体。2.Western blot证实诱饵质粒pBT-ClpE可以正常表达，而且自激活实验证实其无自主激活报告基因作用。通过大肠杆菌双杂交系统的筛选，我们最终得到了25个阳性克隆。经过PCR和测序鉴定，有2个DNA片段在pTRG载体上有正确表达，分别是细胞分裂蛋白FtsW和推测的组氨酸激酶SPD2019。我们重新构建了含有全长片段的pTRG-FtsW/SPD2019载体，并通过双杂交系统验证他们与ClpE具有相互作用。3.通过免疫共沉淀实验的筛选，最终我们得到了6个ClpE相互作用蛋白，分别是丙酮酸氧化酶SpxB，氨肽酶PepN，l-乳酸脱氢酶Ldh，核糖体蛋白RpsD,磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸转移酶PtsI，氨甲酰基-磷酸合成酶CarB。我们选择其中与细菌毒力密切相关的SpxB和PepN进行了双杂交系统的验证，证明这两个蛋白与ClpE具有相互作用。4.对FtsW蛋白的初步功能研究结果显示，FtsW在细菌处于热应激时表达增高。β-半乳糖苷酶活性测定显示FtsW的降解在D39clpE菌中要慢于野生菌。结论通过本研究共筛选到8个蛋白可能与ClpE具有相互作用，其中蛋白FtsW、SPD2019、PepN和SpxB通过鉴定的确与ClpE具有相互作用，提示ClpE可能通过影响这些蛋白的含量影响细菌相关性质及毒力；细胞分裂蛋白FtsW的表达受热应激诱导，而ClpE参与FtsW的降解，提示ClpE对细胞分裂的影响可能是通过调控FtsW的蛋白水平来实现的。