论文部分内容阅读
母羊与繁殖机能相关的系列性状均是经济性状,与其它经济性状相同之处即均受多种基因控制;采用传统的方法进行遗传改良或培育新的高繁殖率品种是非常缓慢且繁琐复杂的,究其原因主要在于绵羊的繁殖性状均为低遗力性状,由于绵羊卵巢生物学及调控机制是绝大多数繁殖性状形成与表现的基础,因此阐明母羊的卵巢发育和排卵生物学过程中的分子调控机制,可为提高母羊的繁殖力提供了新的理论依据。小尾寒羊是世界上为数不多的以高繁殖力而著称的多胎型绵羊品种之一,在我国肉羊业的发展中发挥了独特的作用,因而揭示其卵巢发育的生物学机制,将为充分利用其品种特性、进一步控制其繁殖潜力,具有重要的理论意义。本研究以2月龄、6月龄和12月龄三个年龄段的母羊为研究对象,利用高通量测序技术研究转录组mRNA及miRNA在不同性成熟阶段卵巢组织发育的调控作用。在对2月龄(性成熟前)、6月龄(性成熟后)和12月龄(初配年龄)三个年龄段的卵巢组织中的mRNA、miRNA的表达谱进行分析,获得差异表达的mRNA和miRNA的基础上,再对三个年龄组间的差异mRNA和miRNA分别进行逻辑性趋势分析,对得到的每种趋势模型下的基因分别进行功能分析(GO-Analysis)和信号通路分析(Pathway-Analysis),挑选出显著性和关注的趋势模型。对差异表达的mRNA进行蛋白互作的分析,筛选出调控卵巢发育的关键基因;对得到的每种趋势模型下的miRNA进行靶基因预测,对这些靶基因进行功能分析(GO-Analysis)和信号通路分析(Pathway-Analysis),构建差异表达miRNA与预测到的靶基因之间的的调控网络(miRNA-target mRNA),筛选出调控卵巢发育的关键miRNA及其靶基因。本研究获得的研究结果如下:1.成功构建小尾寒羊2月龄、6月龄和12月龄卵巢组织mRNA文库,分析mRNA表达谱筛选出2月龄vs 6月龄卵巢差异表达mRNA 98个,6月龄vs 12月龄卵巢差异表达mRNA 1478个以及2月龄vs 12月龄卵巢差异表达mRNA 974个。在GO富集分析中,2月龄vs 6月龄卵巢组织的差异表达基因显著富集到157个GO条目;6月龄vs 12月龄卵巢组织的差异表达基因显著富集到237个GO条目;2月龄vs 12月龄卵巢组织的差异表达基因显著富集到225个GO条目。在KEGG富集分析中,2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄卵巢组织的差异表达基因分别显著富集到7、27和18条信号通路。蛋白互作分析中,2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄卵巢差异表达基因分别成功构建了1个,19个和25个蛋白互作网络。成功从2月龄vs 6月龄,6月龄vs 12月龄和2月龄vs 12月龄卵巢差异表达基因蛋白互作网络中分别筛选出1个,8个和7个关键基因。随机选取的9个差异表达mRNA,采用qRT-PCR的方法进行验证,结果证实了RNA-seq测序结果的准确性。2.成功构建小尾寒羊2月龄、6月龄和12月龄卵巢组织miRNA文库。共鉴定出149个已知miRNA,并预测出20个novel miRNA。在2月龄vs6月龄,6月龄vs12月龄以及2月龄vs12月龄卵巢组织中分别筛选出11个,13个和19个差异表达miRNA。2月龄vs6月龄,6月龄vs12月龄以及2月龄vs12月龄卵巢组织中差异表达已知miRNA分别预测到54,37和198个候选靶基因。2月龄vs 6月龄卵巢差异表达miRNA的靶基因主要参与蛋白质的消化吸收以及核苷酸剪切修复信号通路和Hippo信号通路等;6月龄vs 12月龄卵巢组织差异表达miRNA的靶基因主要参与tRNA氨酰化、脂质定位过程以及TGF-β信号通路和及卵母细胞减数分裂信号通路等;2月龄vs 12月龄卵巢差异表达miRNA的靶基因主要参与多细胞生物过程、碱基生物合成以及卵母细胞成熟以及卵母细胞减数分裂信号通路等。成功构建3个miRNA-靶基因调控网络,从中筛选出oar-miR-432及其候选靶基因RPS6KA1和oar-miR-143及其候选靶基因CDK2作为后续验证研究的对象。随机选取的9个差异表达miRNA,采用qRT-PCR的方法进行验证,结果证实了RNA-seq测序结果的准确性。3.oar-miR-432可以与RPS6KA1基因的3’-UTR特异性靶向结合,抑制RPS6KA1的表达,说明RPS6KA1是oar-miR-432的靶基因。oar-miR-143可以与CDK2基因的3’-UTR特异性靶向结合,抑制CDK2的表达,说明CDK2是oar-miR-143的靶基因。