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目的:肺癌是全球癌症死亡主要原因。吸烟作为环境常见暴露因素,是肺癌发生的重要危险因素。肿瘤干细胞是存在于肿瘤中的起始细胞,具有自我更新、多向分化、侵袭转移、多重耐药等能力。莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)是存在于天然植物中的异硫氰酸盐类化合物,对多种类型肿瘤都具有干预作用。本研究采用细胞体外模型,在领域内创新性地探讨ANp63α和Notch轴在人正常支气管上皮细胞(NHBE)向肺癌干细胞恶性转化过程中的调控机制以及SFN的干预作用,旨在为探索吸烟诱导肺癌发生和有效干预的分子机制和其关键靶点提供重要的科学依据。方法:NHBE细胞经慢性吸烟暴露55代后得THBE细胞;体外克隆成球分选法即无血清悬浮培养分离富集肺癌干细胞;显微镜下观察NHBE细胞形态及THBE悬浮成球能力变化;软琼脂集落形成实验检测THBE细胞恶性程度;Transwell实验检测细胞侵袭转移能力;转染技术高表达或低表达△Np63α水平;Western blotting 检测恶性相关分子(E-cadherin、ZO-1、N-cadherin、Vimentin)、肺癌干细胞标志分子(CD133、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog、Sox2)、ANp63α以及Notch通路信号分子(NICD、Hes1)表达水平;双荧光素酶报告基因检测Notch1荧光强度变化。结果:1.慢性吸烟暴露诱导NHBE细胞发生恶性转化2%香烟烟雾连续处理NHBE细胞55代,镜下观察发现细胞由纺锤形、圆形或卵石形变为梭形、扁平状或条索状;软琼脂集落形成实验和平板克隆实验同时证明THBE细胞克隆形成能力显著提高;Transwell实验显示THBE侵袭转移能力增强;Western blotting结果显示,THBE细胞上皮标志分子E-cadherin、ZO-1蛋白水平降低,间质标志分子N-cadherin和Vimentin表达上调。上述结果表明,THBE细胞具有肿瘤样细胞特性,在我们的研究体系中已成功建立慢性吸烟暴露诱导NHBE向肺癌细胞转化的细胞模型。2.THBE细胞具有肺癌干细胞活性无血清悬浮培养发现THBE细胞能形成克隆球,并且高表达肺癌干细胞标志分子:CD133、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog。说明我们采用克隆成球分选法能成功富集THBE肺癌干细胞。3.ANp63α在吸烟诱导NHBE向肺癌干细胞恶性转化过程中具有调控作用ANp63α在THBE贴壁细胞及悬浮细胞球中高表达;高表达ANp63α使THBE细胞克隆形成能力远高于THBE及CHBE细胞;并且高表达△Np63α可以使THBE细胞的无血清成球能力提高,肺癌干细胞标志分子蛋白表达升高;低表达ANp63α使THBE细胞的成球能力下降,肺癌干细胞标志分子蛋白表达下调。说明△Np63α促进NHBE向肺癌干细胞的恶性转化。4.Notch通路调控THBE肺癌干细胞活性经Western blotting检测,Notch通路在THBE肺癌干细胞中被激活,Notch通路抑制剂DAPT处理后,THBE肺癌干细胞活性被抑制,成球能力及肺癌干细胞相应的标志分子蛋白水平显著下调。由此可知,Notch通路在THBE肺癌干细胞活性中起着重要作用。5.THBE肺癌干细胞中ANp63α对Notch信号通路的调控作用低表达ANp63α使Notch、Hes1蛋白抑制,Notch荧光强度下降;高表达ANp63α使Notch、Hes1蛋白激活,Notch荧光强度增强。以上结果说明,ANp63α能正向调控Notch的转录活性。6.莱菔硫烷对THBE肺癌干细胞活性的抑制作用不同浓度的SFN(0、10μM、15 μM、20μM)处理THBE肺癌干细胞后,THBE肺癌干细胞球的大小和数量受到抑制,肺癌干细胞标志分子蛋白水平也出现剂量依赖地下调。这些结果表明,SFN能有效抑制THBE肺癌干细胞的活性。7.ANp63α介导莱菔硫烷对THBE肺癌干细胞的抑制作用经SFN处理THBE肺癌干细胞后,ANp63αα表达水平下调。高表达ANp63α同时联合SFN处理,镜下观察及western blot结果显示高表达ANp63α能逆转SFN对THBE干细胞的抑制作用。以上结果说明ANp63α介导莱菔硫烷对THBE肺癌干细胞的抑制作用。8.莱菔硫烷通过下调△Np63α介导的Notch来抑制THBE干细胞SFN处理THBE肺癌干细胞使Notch通路蛋白水平表达下调,在THBE细胞中转入Luc-wt-Notch,同加入SFN进行干预处理,双荧光素酶报告基因结果显示SFN抑制Notch的转录活性。SFN与ANp63α联合处理后,高表达△Np63α对THBE干细胞Notch通路的激活作用被SFN有效地逆转。以上结果说明,SFN通过下调ANp63α介导的Notch来抑制THBE干细胞活性。结论:在慢性吸烟暴露诱导人正常支气管上皮细胞恶性转化进程中,本研究率先揭示△Np63α能通过Notch通路发挥对肺癌干细胞的促进作用,而SFN能进行有效干预。为预防和控制肺癌的发生发展提供新思路。