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目的：研究氯化两面针碱对肝癌细胞恶性增殖的抑制及对DNA聚合酶6催化亚基p125表达及调控通路的影响,基于p125调控通路探讨氯化两面针碱抑制肝癌细胞恶性增殖的作用机制。方法：1.应用MTT比色法和细胞单克隆集落形成实验测定氯化两面针碱对人肝癌细胞SMMC-7721、BEL-7402增殖的抑制及恶性度的影响。2.通过In-cell western实验检测p125在人肝癌细胞及人正常肝细胞中的表达,同时,应用RT-PCR实验检测其编码基因POLD1的表达。3.通过western blot实验检测不同浓度氯化两面针碱对p125表达的影响。4.采用实时荧光定量Real-timePCR检测不同浓度氯化两面针碱对p53、p21表达水平的影响；酶联免疫吸附法ELISA测定P53、P21表达的变化。5.通过脂质体法用Lipo2000转染p53重组真核表达质粒pGPU6/GFP/neo-p53-shRNA,p21重组真核表达质粒pGPU6/GFP/neo-P21-shRNA和阴性对照空白载体质粒pGPU6/GFP/neo-NCshRNA到细胞SMMC-7721内,经G418筛选,分别得到p53低表达组7721-p53shRNA,p21低表达组7721-p21shRNA和空载体组7721-NCshRNA稳定细胞系,RT-PCR鉴定稳定转染后p53、p21基因表达的变化；western blot检测p53、p21低表达后对p125表达的影响。通过western blot检测氯化两面针碱作用稳定细胞系后对p125蛋白表达影响的差异。6.免疫沉淀(IP)实验检测在肝癌细胞内P53与p125的相互结合情况。7.Real-time PCR检测在转染细胞内,p53表达变化对p21基因表达的影响及氯化两面针碱对p21基因表达影响的变化。8.Real-time PCR测定氯化两面针碱对细胞周期基因CDK2、CyclinE、c-myc.E2F.Rb-1mRNA表达的影响。结果：1.与阴性对照相比,氯化两面针碱(0.15、0.30、0.60、1.20、2.40、4.80mg/L)浓度依赖性地提高对肝癌细胞SMMC-7721.BEL-7402的抑制率,对肝癌细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05),作用48h时IC50值分别为(1.08±0.13)、(1.35±0.21)mg/L；氯化两面针碱可明显抑制细胞克隆集落形成(P<0.05),0、0.25、0.50、1.0mg/L处理细胞14d后,SMMC-7721细胞克隆形成率分别是(83.58±6.452)％.(25.35±2.765)％.(11.52±0.921)％.0%；BEL-7402细胞克隆形成率分别是(87.13±7.312)%、(30.38±1.783)%、(13.22±1.421)%、(4.35±0.937)%。2.与正常细胞相比,肝癌细胞中p125的表达明显升高(0.98±0.14比0.33±0.21,P<0.01)；其编码基因POLD1的表达也明显增强(P<0.05)。3.而氯化两面针碱作用后,SMMC-7721、BEL-7402细胞内p125的表达明显降低(P<0.05)。4.与阴性对照组比,氯化两面针碱明显提高p53(P53)、p21(P21)的表达(P<0.05)。5.稳定转染后,得到p53、p21低表达细胞系。在肝癌细胞中,干扰p53、p21后,p125表达增强(P<0.01)。而氯化两面针碱作用稳定细胞系后,氯化两面针对p125的下调作用减弱了6.P53沉淀时未能检测到p125。7.在p53低表达组7721-p53shRNA细胞中,p21mRNA表达明显降低(P<0.05),而在p53高表达组7721-p53细胞中,p21mRNA表达明显增强(P<0.05)；用1.0mg/L氯化两面针碱处理7721-p53shRNA和7721-NCshRNA,p21mRNA表达显著性升高(P<0.01),且在7721-p53shRNA组内的表达高于阴性对照7721-NCshRNA组。8.不同浓度氯化两面针碱对CDK2/c-mYc mRNA表达没有明显影响,差异没有统计学意义(P>0.05)；但明显降低CyclinE的基因表达(P<0.01)；在一定浓度范围内,氯化两面针碱对E2F,Rb-1基因的表达具有一定上调的作用(P<0.01)。结论：氯化两面针碱能显著抑制肝癌细胞的恶性增殖和肝癌细胞的恶性度,并能降低肝癌细胞中异常表达的p125。在肝癌SMMC-7721细胞内,存在p53对p125的负性调控,氯化两面针碱对p125的影响可能与上调p53的表达有关。氯化两面针碱可能通过诱导p53上调,上调的p53与p125编码基因POLD1启动子结合,抑制p125的表达,从而抑制肝癌细胞的恶性增殖。氯化两面针碱通过依赖和非依赖p53途径共同诱导p21上调。同时,在肝癌细胞内,p21也参与了对p125的调控；氯化两面针碱抑或通过上调p21,抑制细胞周期素CyclinE,进而抑制p125的表达,最终抑制肝癌细胞的恶性增殖。