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摘要:[目的]对胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。[方法]从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用RT-PCR的方法扩增GFAP序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。[结果]目的载体构建完成后,用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。[结论] pGEX-4T-2-GFAP原核表达载体的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗奠定了基础。背景:胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。目的:对GFAP进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。设计、时间及地点:单一样本研究,于2008-09/11上海市长征医院神经外科实验室完成。材料:中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。方法:从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用RT-PCR的方法扩增GFAP序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。主要观察指标:总RNA鉴定结果,PCR扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。结果:目的载体构建完成后,用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。结论:pGEX-4T-2-GFAP原核表达载体的成功构建,为进一步研究出有效的基因工程疫苗奠定了基础。