梅花鹿茸抗骨质疏松胶囊(下文简称鹿茸胶囊)由鹿茸、葛根、补骨脂和黄瓜籽四味药材组成,为控制其质量,本试验以16份药品样品以及4份阴性对照样品作为试验材料,从定性鉴别和定量分析两个方面,对鹿茸胶囊进行分析和评价,并以补骨脂素和异补骨脂素作为指标性成分建立鹿茸胶囊的指纹图谱,从而进一步完善和提高药品的质量标准,为实际生产和临床应用提供科学依据。1、定性鉴别本试验按照2015版《中华人民共和国药典》中相关规定,并综合有关文献对各味药材的鉴别方法,从供试品处理方法、薄层色谱条件、显色条件以及点样量等方面进行优化,从而选择出鉴别的最适方法。本试验所用的鉴别方法具有专属性强、简便精确的特点。结果显示鹿茸、葛根、补骨脂及黄瓜籽的色谱均条带清晰、斑点明显,与对照品在相同位置处有同颜色斑点,阴性对照无干扰,可列入鹿茸胶囊的质量标准。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中的有关要求,以补骨脂素和异补骨脂素作为指标建立鹿茸胶囊的HPLC指纹图谱。采用Agilent-C18(5μm,4.6×250mm)色谱柱;甲醇(A):水(B)梯度洗脱;检测波长318 nm;柱温;25℃;进样量:10μL作为指纹图谱的色谱条件,对16份样品及4份阴性对照样品进行指纹图谱检测,经方法学考查证明该方法稳定精确可靠。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)分析各样品的HPLC色谱图并对相似度进行评价,结果显示1-16号样品相似度均在0.8以上。2、定量分析利用高效液相色谱法(HPLC)检测补骨脂素、异补骨脂素和葛根素含量;二喹啉甲酸法(BCA)检测胶原蛋白含量;氨基酸自动分析仪检测氨基酸含量;钙、锌、铁利用原子吸收分光光度计检测其含量;紫外分光光度计法测定多糖和磷的含量。补骨脂素和异补骨脂素的检测:鹿茸胶囊甲醇超声提取30min;甲醇-水梯度洗脱;检测波长240nm。补骨脂素和异补骨脂素均在5~25μg/mL范围内有较好的线性关系;该方法重复性良好,RSD分别为1.15%、0.76%;加样回收率分别为99.7%、100.7%。确定鹿茸胶囊中补骨脂素和异补骨脂素分别不得低于0.207mg/g、0.209mg/g。葛根素的检测:鹿茸胶囊30%乙醇超声提取30min;流动相:甲醇-水(25:75);检测波长250 nm。葛根素在0.96~4.8μg/mL范围内具有较好的线性关系;该方法重复性良好,RSD为2.01%;加样回收率为98.4%。确定鹿茸胶囊中葛根素含量不得低于38.57μg/g。胶原蛋白的检测:采用胰蛋白酶水解法从鹿茸胶囊中提取胶原蛋白,依次将牛血清蛋白标准品溶液、样品溶液、阴性对照品溶液、BCA工作液点入96孔板中,利用酶标仪测定OD562nm值,胶原蛋白在0.5~10μg/mL范围内具有较好的线性关系。确定鹿茸胶囊中的胶原蛋白含量不得低于29.73%。多糖的检测:样品中加入HCl溶液,沸水浴提取60min,NaOH溶液中和后加入DNS,沸水浴5min,紫外分光光度计检测OD503nm值,得出总糖的含量。样品经85%乙醇回流提取3次,提取液回收乙醇,加DNS,沸水浴5min,紫外分光光度计测定OD520nm值,得出还原糖的含量。最后多糖=总糖-还原糖。总糖和还原糖含量在0.02~0.08mg/mL范围内具有良好的线性关系。确定鹿茸胶囊中的多糖含量不可低于8.79 mg/g。氨基酸的检测:样品加盐酸,110℃水解22h。仪器条件:离子交换柱4.6mm×60mm、3μm磺酸型阳离子树脂;柱温57℃;反应温度135℃;分离缓冲液流速0.40mL/min;茚三酮反应液流速0.35mL/min;波长570、440nm;分析时间30min。确定鹿茸胶囊中氨基酸的总量不得低于22.72%,必需氨基酸的总量不得低于10.88%。无机元素的检测:样品经高氯酸+硝酸消解液消解后,利用原子吸收分光光度计检测,钙、锌、铁三种元素分别在4~20μg/mL、0.5~2μg/mL、2~8μg/mL范围内线性关系良好。再用紫外分光光度计测定OD660nm值,检测磷的含量,磷含量在5~50μg/mL范围内具有良好的线性关系。确定鹿茸胶囊中钙、磷、锌、铁四种元素的含量不得低于32.33%、6.39%、0.12mg/g、0.62 mg/g。各定量分析检测方法具有较好的精密度、稳定性和重复性,可用于对梅花鹿茸抗骨质疏松胶囊中各成分的质量控制。