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苯乙腈(Phenylacetonitrile,PAN)是微生物、植物和动物的重要代谢产物,在它们与其它生物互作中发挥重要的信息传递和防御功能。有关PAN的生物合成途径以及合成途径上相关基因/酶的鉴定在微生物和植物中有一定的报道,而在动物界仅知道苯丙氨酸作为PAN的前体物质,但具体的合成途径及分子机制并不清楚。 本研究以飞蝗为模型,发现苯乙腈是群居飞蝗幼虫各龄期的主要挥发物,但与性别无关,并且在龄期的中期释放量高,在蜕皮前后释放量低,组织特异性分布在头部、表皮和腿部;在成虫阶段由6~18天左右的群居型雄虫释放,组织特异性分布在表皮和腿部,既跟两型相关,又跟性别密切相关。可见,飞蝗PAN合成是一个表型可塑性的调控过程。因此,解析PAN在飞蝗体内合成的生化和分子机制不仅对能进一步揭示PAN的产生和调控机制,而且对于理解其生物学功能以及与蝗虫型变的关系都有重要的意义。 进一步研究采用稳定同位素示踪的方法首次证明飞蝗体内PAN的合成遵循“苯丙氨酸-Phe002-Phe003-苯乙腈”的途径。并且发现散居型也能利用Phe003形成PAN,说明“Phe003-苯乙腈”的过程在群、散中没有差异,造成群、散PAN含量差异的关键在于Phe003的合成。已知植物中催化苯丙氨酸形成Phe003的反应是P450酶。通过群、散飞蝗转录组的比较筛选了群居型高表达、散居型低表达的P450基因,并结合RNA干扰成功地鉴定到PAN合成通路上负责催化生成Phe003的关键基因lm0000。这是在动物界首次发现的PAN代谢途径的关键酶。 研究发现lm0000主要有3种剪接方式,其中isoform3的mRNA在群居型雌、雄蝗蝻的头部、腿部、表皮以及群居型雄性成虫的腿部、表皮中特异性表达,并且在蛋白水平也得到了验证,这些组织同时也是生成PAN的部位,推测isoform3是催化合成PAN的形式。 值得注意的是,在群居型雌性成虫的腿部这样一个没有PAN生成能力的组织中也有lm0000.isoform3 mRNA水平的表达,而没有蛋白水平的表达,推测该组织中存在某种转录后调控,使mRNA不能完成蛋白质翻译,从而无法行驶催化功能。这对于后续研究lm0000在不同组织中的表达调控有重要的意义。 本文还探索了体外表达lm0000和P450氧化还原酶lmCPR的方法,用于后续研究lm0000调控PAN合成的直接证据。