目的:本文从物质基础和药效学两个方面,对瓜蒌及其蒸制品的功效差异和关联物质基础进行比较性研究。一是采用红外吸收光谱法(Infrared absorption spectroscopy,IR)、紫外-可见分光光度法(Ultraviolet and visible spectrophotometry,UV)及高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)对瓜蒌及其蒸制品化学成分进行研究,并建立10批瓜蒌及其蒸制品的化学指纹图谱。二是采用大鼠心肌缺血-再灌注(Ischemia resperfusion,I/R)模型进行药效学研究。明确瓜蒌及其蒸制品功效及关联物质基础的差异,为瓜蒌蒸制方法的改进提供理论依据,对瓜蒌合理炮制、加工等也具有指导意义。方法:1.瓜蒌及其蒸制品光谱学研究比较:将合格的瓜蒌药材,采用IR进行测定,并对瓜蒌及其蒸制品红外光谱图进行比较,分析蒸制工艺对瓜蒌主要化学成分类别的影响,并推断出其主要成分。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对瓜蒌及其蒸制品的原始红外光谱数据及一阶导数红外光谱数据进行相似度评价,建立共有模式,并计算相似度。采用SIMCA-P 11.0统计软件,建立主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)模型和偏最小二乘判别分析(Partial least-squares discriminant analysis,PLS-DA)模型,得分散点3D图和变异重要性指标(Variable Importance,VIP)值,得出各吸收峰对瓜蒌各样品的差异影响的贡献率。再按照前期建立的提取工艺,制备瓜蒌及其蒸制品供试品溶液,用紫外-可见分光光度法测定其总氨基酸、总黄酮和总皂苷、还原糖和总糖的含量。2.瓜蒌及其蒸制品HPLC指纹图谱的研究:选取瓜蒌及其蒸制品各10批,采用高效液相色谱-二极管阵列检测法(High performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)建立瓜蒌及其蒸制品中药指纹图谱,对其中特征性成分(5-羟甲基糠醛、香草酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素)进行定量分析,并进行方法学验证。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》,对瓜蒌及其蒸制品HPLC指纹图谱进行相似度评价,建立共有模式,计算相似度。采用SIMCA-P 11.0统计软件,建立PCA模型和PLS-DA模型,得分散点3D图和VIP值,得出各单一化学成分对瓜蒌及其蒸制品间差异的贡献率。3.瓜蒌及其蒸制品抗大鼠心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)药效学差异研究:釆用无特定病原体(Specific patho gen Free,SPF)级雄性斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley,SD)大鼠随机分为9组(n=10):假手术组、心肌缺血-再灌注(Ischemia resperfusion,I/R)模型组、瓜蒌组、蒸瓜蒌组。采用结扎大鼠冠状动脉左前降支(Left desending coronary artery,LAD)30 min,解结扎120 min的方式建立MIRI模型。(1)采用标准Ⅱ导联连续监测心电图,以ST段抬高及心脏局部紫绀为标准,观察每组大鼠心肌缺血-再灌注心电图的变化情况;(2)采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法测定血浆中各生化指标:肌酸激酶同工酶(Creatininekinase,MB isoenzyme,CK-MB)、心肌肌红蛋白(Myogiobin,MYO)、心肌肌钙蛋白-T(Troponin-T,c Tn T)的水平;(3)采用伊文氏蓝(Evans blue)、氯化三苯基四氮唑(Triphenyl tetrazolium chloride,TTC)双染,根据染色情况,比较各组间心脏缺血危险区和心脏梗死区面积;(4)对大鼠缺血区心肌组织进行苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)以观察心肌病理变化,并用光镜观察大鼠心肌组织结构的变化情况。结果:1.光谱学研究:(1)采用IR对化学成分类别定性分析和UV对总氨基酸、总黄酮和总皂苷、还原糖和总糖化学成分定量分析,阐明了瓜蒌及其蒸制品化学成分类别及其有效成分的变化。与瓜蒌比较,瓜蒌蒸制品,总氨基酸、总黄酮含量分别降低17.2%、42.8%;总皂苷、总糖和还原糖含量分别增加4.3%、43.6%、68.2%,其中总糖含量增加最多,总皂苷含量变化最小。(2)采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》,将瓜蒌及其蒸制品之间的原始红外光谱图和一阶导数红外光谱图进行比较,瓜蒌及其蒸制品原始红外光谱图相似度较高,一阶导数红外光谱图相似度较差。由原始红外光谱图可推断出,蒸制没有使瓜蒌及其蒸制品化学成分类别发生太大改变。通过计算各光谱峰VIP值,得出7个VIP值较大的峰,其中1456cm-1,1726cm-1处的CC=ν和OC=ν是引起瓜蒌及其蒸制品之间变化差异的主要光谱峰。2.色谱学研究:(1)建立了瓜蒌及其蒸制品的特征指纹图谱,并对其中6个特征峰(5-羟甲基糠醛、香草酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素和木犀草素)进行了定量检测。与瓜蒌比较,瓜蒌蒸制品中5-羟甲基糠醛含量大幅度增加,约为蒸制前的25倍;香草酸、芦丁和异槲皮苷含量分别增加26.3%,10.0%,25.0%;槲皮素和木犀草素含量分别减少75.5%,35.0%。(2)10批瓜蒌及其蒸制品共有54个共有峰,10批瓜蒌组间相似度为0.82~0.86之间,10批瓜蒌蒸制品组间相似度为0.97~0.98之间。在共有模式的基础上,对瓜蒌及其蒸制品特征性成分含量进行比较,其中5-羟甲基糠醛、香草酸、槲皮素和木犀草素蒸制前后变化显著(P<0.01)。3.瓜蒌及其蒸制品抗MIRI药效学差异研究:(1)与模型组比较,瓜蒌及其蒸制品对大鼠心肌缺血损伤时期ST段的抬高均有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01);与瓜蒌组比较,瓜蒌蒸制品对抗大鼠心肌缺血损伤时期心电图ST段的抬高效果较差。(2)与假手术组比较,模型组血浆CK-MB、MYO、c Tn T的含量明显升高(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,阳性对照组CK-MB、MYO、c Tn T的含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与瓜蒌比较,瓜蒌蒸制品高、中剂量组c Tn T的含量明显增加(P<0.05或P<0.01),高剂量组和低剂量组中MYO含量明显增加。(3)与模型组相比,阳性对照组心肌梗死面积显著减少(P<0.01)。与瓜蒌蒸制品比较,瓜蒌高浓度组可有效缩小心肌梗死面积(P<0.01),对大鼠心肌缺血再灌注均具有明显保护作用(P<0.05或P<0.01),且较复方丹参滴丸组作用稍差,但无统计学差异。(4)光镜检查结果显示,与瓜蒌进行对比,瓜蒌蒸制品的心肌组织排列较较为疏散,肌肉横纹断层明显,炎性浸润较未炮制组明显,且空泡样变显著。结论:瓜蒌及其蒸制品化学成分类别上无明显差异,化学成分含量上具有一定的差异性,瓜蒌蒸制品化学成分更为集中;瓜蒌及其蒸制品均有一定的抗MIRI作用,同剂量组,瓜蒌优于瓜蒌蒸制品,且具有一定量效关系。因此,瓜蒌蒸制品虽然易于保存、运输,但抗MIRI作用也有所降低,在物质基础和药效学上存在一定差异性。该研究为瓜蒌蒸制方法的改进提供理论依据,对促进瓜蒌的合理加工等也具有指导意义。