研究背景与目的：炎症性肠病(inflammatory bowel disease. IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC),是发生在胃肠道的慢性炎症性疾病[1]o IBD发病普遍,在美国约有1400万患者,在欧洲有2200万IBD患者[2-3]。近年来,我国的IBD发病率呈上升趋势。但其病因和发病机制尚不清楚,可能是环境因素、免疫、遗传、感染等多种因素相互作用,某种抗原的持续刺激,启动了肠道免疫炎症过程,最终导致免疫反应过度亢进和难以自限。目前研究认为促炎因子及抑炎因子的平衡是维持机体正常功能的保障,而各种T细胞分泌的多种炎症因子失调是引起IBD的主要原因。细胞因子是指机体的免疫细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞和单核细胞等)和非免疫细胞(如血管内皮细胞、表皮细胞和成纤维细胞等)合成和分泌的一组具有广泛生物活性的小分子多肽细胞因子,可划分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。根据免疫调节功能和分泌的细胞因子的不同,目前CD4+T细胞至少可分化为Th1、Th2、Treg、Th17等4个细胞亚群。IBD之前一直被认为是由产生IFN-γ的Thl和产生IL-4/IL-13的Th2介导的,直到最近很多研究报道Kobayashi等[4]发现IBD患者的肠黏膜组织中Th17细胞以及IL-17、L-21、IL-22等的表达明显高于正常对照,而在肠黏膜病变区域中上述指标亦明显高于非病变区域,活动期IBD病人血清中IL-17、IL-21、IL-22水平亦升高。与此相似,Seiderer等人在活动性CD患者体内发现,IL-17F mRNA表达水平升高。Th17细胞被认为是介导IBD炎症反应的重要细胞。Th17细胞由IL-6和TGF-β诱导分化,在有IL-23存在的情况下维持和增殖,其分泌的细胞因子包括IL-17(Interleukin-17)A-IL-17F, IL-6, TNF-α, IL-22等。IL-17是Th17细胞分泌的主要细胞因子也是Thl7细胞的主要效应因子。目前,IL-17家族有6个配体(IL-17A-F)和5个受体(IL-17RA.RD和SEF)[6]。通常IL-17是指IL-17A是Th17细胞的主要效应细胞因子,通过作用于肠道上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞及结肠肌纤维母细胞等,诱导释放促炎性趋化因子、细胞因子及其他促炎介质(如前列腺素、粒细胞集落刺激因子等),介导粒细胞的早期动员,参与早期炎性介质反应。同时介导淋巴细胞及树突状细胞的大量募集及聚集,维持肠道持久的炎性介质反应。另外,IL-17A还参与中性粒细胞的增生、成熟及凋亡,促进树突状细胞成熟,通过多种途径引发炎性介质反应[7]。IBD的传统治疗着眼于控制活动性炎症、维持缓解和调节免疫紊乱,常用的三类药物包括水杨酸类、糖皮质激素和免疫抑制剂。它们的治疗具有一定的局限性和不可避免的副作用。其对CD与UC的缓解率分别仅为70%与80%左右,最佳的维持缓解方案也仅能使复发率降低50%左右,分别约有2/3与1/3的病例最终需手术治疗。而且免疫抑制剂起效时间过长(3-6月),相当比例的患者对此类药物无效。随着对IBD发病机制的深入研究,生物靶向治疗成为IBD治疗新趋势[8]。TNF-α是CD关键的促炎反应介质,因而是IBD治疗中的重要靶点。目前最常用的TNF-a拮抗剂是英夫利昔单抗(infliximab)。英夫利昔单抗是一种可直接拮抗TNF-α的人鼠嵌合单克隆抗体,已被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于治疗难治性CD。数项多中心双盲临床研究证实英夫利昔单抗对活动性CD特别是对有瘘管形成者有效,但也易伴发严重继发感染等不良反应。抗代谢药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是临床大肠癌的经典一线化疗药物,分子结构是尿嘧啶的5号位氢被氟所取代的衍生物。其结构与尿嘧啶和胸腺嘧啶相似,在血管内可被细胞迅速摄取且沿多种途径迅速代谢转化为其活性代谢产物5氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5FdUMP)和5-氟尿嘧啶嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(5FdUTP),主要作用在细胞周期的S期。5FdUMP以还原性叶酸为辅酶抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(ThymidylateSynthase,TS)活性,继而导致细胞内DNA合成前体胸腺嘧啶三磷酸脱氧核苷酸(dTTP)缺乏；5FdUTP则直接掺入RNA；此外,5FdUMP也可进一步磷酸化为5FdUTP,直接掺入DNA,抑制DNA链的延长,同时改变DNA的稳定性,继而引起DNA双链断裂；氟脲嘧啶还可能通过dTTP缺乏影响DNA修复功能而引起DNA链的断裂。临床使用大剂量的5-FU化疗后主要的毒副作用是全面的骨髓抑制和胃肠道反应。由于目前尚未发现肿瘤细胞有特有的代谢途径,而正常细胞与肿瘤细胞之间生长分数的差别,理论上抗代谢药物仍能杀死肿瘤细胞而不影响正常的细胞。随着5-FU在临床上越来越广泛的应用,研究者已逐渐拓宽了该药的治疗范围,在许多新的领域内的疾病应用中、低剂量的5-FU都取得了良好的效果。已有很多报道[9-23]5-FU临床用于局部组织,通过抑制胰蛋白酶的活性有效治疗急性胰腺炎、通过抑制纤维母细胞生长以防止眼科手术术后机化粘连及治疗耳廓假性囊肿、通过抑制5一n还原酶的活性,阻止睾酮转变成双氢睾酮来治疗以腺体增生为主的前列腺增生、通过抑制DNA合成有效治疗皮肤白化病、慢性化脓性上颌窦炎、口腔粘膜白斑、外阴白色病变、介入治疗输卵管妊娠、银屑病、慢性鼻炎、腋臭及复发性尖锐湿疣等,在上述报道中5-FU在治疗剂量下均未见局部组织坏死的报道。我们课题组发现在术前接受5-FU化疗的大肠癌病人中,其肠壁组织的T-bet、 RORyt表达水平较化疗前显著降低,而T-bet、RORyt分别是Th1、Th17重要的转录因子,提示5-FU可能有抑制Th1、Th17细胞的作用,但是5-FU是细胞毒药物,大剂量的5-FU作用于活体会出现明显的骨髓抑制和胃肠道反应等副作用,我们设想低剂量的5-FU具有选择性抑制免疫细胞Th1、Th17的作用,从而为IBD治疗新途径提供新的思路和有效依据。研究内容1.收集术前接受5-FU化疗的大肠癌病人化疗前及化疗后肠组织标本,检测Th1、Th17、Treg细胞相关指标mRNA的表达,HE染色及免疫荧光染色(immunofluorescence, IF)观察肠粘膜Th1、Th17细胞相关标记的表达。2.制作化学物质诱导及免疫细胞转移IBD小鼠模型,分别检测高低剂量的5-FU对不同的IBD小鼠模型肠炎的疗效及相关副作用的观察。3.体外培养野生型小鼠(Wild Type, WT)脾和肠系膜淋巴结提取的CD4+T细胞,往Th1、Th17及Treg方向极化,观察低剂量5-FU对Th cell相关细胞因子及转录因子的作用。体外分离小鼠肠道固有层淋巴细胞(LPL),往Th0及Th17方向极化,观察低剂量5-FU对小鼠LPL中Thl7相关标志的影响。4.探讨低剂量5-FU抑制Th1、Th17相关细胞因子及转录因子的机制。对象与方法1.术前接受5-FU化疗的大肠癌病人的入组及标本获取：选取2010--2013年期间在南方医院住院、术前接受消化道内镜检查及接受5-FU化疗并手术治疗,确诊为大肠癌病人并且资料完整的患者。签署知情同意书后,登记每例患者的一般情况、临床表现、检查及治疗记录等。分别于病人术前及化疗前及化疗后在消化道内镜检查期间或手术结束后快速采集患者病灶处标本,无菌PBS缓冲液冲洗后取部分标本立即置入4%中性甲醛溶液中固定,行常规HE染色及IF染色。其余组织放入标本保存液中随后保存于-80℃冰箱,提取组织RNA,采用逆转录PCR法(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测组织内Th1、Thl7及Treg相关因子转录水平。2.制作化学物质诱导IBD小鼠模型：选用SPF级6-8周龄C57BL6小鼠20只,给小鼠饮用3%硫酸葡聚糖(Dextran sodiuM sulfate; DSS)溶液6天,制作化学物质诱导急性肠炎模型。小鼠随机分为"PBS对照组”、“高剂量5-FU组”及“低剂量5-FU组”,分别于DSS给药周期的第1天开始按10UL/g体重腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)PBS、50mg/kg的5-FU及10mg/kg5-FU。每日观察小鼠体重、毛发色泽、活动度及观察是否排稀便、血便。3.制作免疫细胞转移IBD小鼠模型：流式分选提取于C57BL6WT小鼠脾和肠系膜淋巴结的高表达CD45RB分子的CD4+T细胞(CD4+CD45RBhi,初始T细胞),按3-5X105腹腔注射6-8周龄Ragl-/-小鼠.3周后每间隔3天按10UL/g体重腹腔注射PBS、10mg/kg5-FU。每次观察小鼠体重、毛发色泽、活动度及观察是否排稀便、血便。上述两种肠炎小鼠标本收集及检测：小鼠常规麻醉、处死并收集血液、肠系膜淋巴结、大肠及骨髓标本。按H-E染色法行常规组织病理学检查,观察组织炎症情况及专科病理医师炎症程度评分；采用RT-PCR检测组织内Th1、Th17及Treg相关因子转录水平；采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测各组小鼠血清Th1、Th17细胞因子含量。制备肠系膜淋巴结单细胞悬液,乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristate acetate, PMA)及INOMESIN刺激后5-5.5小时流式染色CD4、IL-17A及IFN-γ,检测Th1、Th17相关细胞因子。分别制作小鼠血涂片和骨髓涂片,Wright染色观察骨髓抑制情况。5.体外培养野生型小鼠(Wild Type, WT)脾和肠系膜淋巴结提取的CD4+T细胞,往Th1、Th17及Treg方向极化,收集T辅助细胞和巨噬细胞上清ELISA检测相关细胞因子水平、流式染色上机观察细胞因子及转录蛋白表达水平,Western Blot检测蛋白表达水平,采用RT-PCR检测组织内Th1、Th17及Treg相关因子转录水平。体外分离小鼠肠道固有层淋巴细胞(LPL),往Th0及Th17方向极化,观察低剂量5-FU对小鼠LPL中Th17相关标志的影响。4.采用人肾胚细胞(293T)细胞,转染RORΓT、STAT3、T-bet及HA-UB等重组质粒,加入不同剂量的5-FU,在不同的时间点收集细胞蛋白。采用Western Blot及免疫沉淀(IP)检测相关蛋白表达水平。采用荧光素酶报告基因(Luciferace)检测蛋白与DNA结合水平。采用Chip assay分别检测5-FU对Thl细胞T-bet与STAT4结合和Th17细胞中RORΓT与STAT3结合的影响。5.采用凋亡试剂盒对不同剂量5-FU处理的SW620及Th0细胞染色,流式上机。6.统计学分析动物及人体试验部分采用SPSS17.0软件(Chicago, Illinois, USA)进行统计学分析。计量资料以X+_S表示,数据符合正态分布(Normality test)及方差齐同(Levene方差齐性检验)的条件下,两组间均数比较采用独立样本T检验,配对资料采用配对样本T检验,多组间均数比较采用单项方差分析(One-way ANOVA检验),多重比较采用LSD法；若数据正态分布但方差不齐,两组间采用Satterthwaite近似T检验,多组间采用近似F检验Welch法。以P<0.05计为有显著统计学差异。结果1.共入选术前接受5-FU化疗的大肠癌病人8例、术前未接受化疗的大肠癌病人8例、术前接受其他化疗方式的大肠癌病人8例。IF结果显示接受5-FU化疗的大肠癌病人肠组织病灶周围RORΓT及T-bet的表达较化疗前显著降低,而术前未接受化疗及接受其他方式化疗的大肠癌病人肠组织病灶周围RORΓT及T-bet的表达水平无显著变化。术前接受5-FU化疗的大肠癌病人肠组织的RT-PCR提示Thl及Th17相关的IL-17A、RORyT及IFN-γ、T-betmRNA表达水平5-FU化疗后较化疗前显著降低,而其他分组无明显变化。2.DSS造模小鼠出现体重减轻、稀便甚至血便等表现或症状。“高剂量5-FU组”出现体重减轻较"PBS组”早,体重减轻幅度较大,肠道组织大体及镜下炎症程度较重,病理评分显著高于"PBS组”。P值而“低剂量5-FU组”出现体重减轻较"PBS组”较晚,体重减轻幅度较小,肠道组织大体及镜下炎症程度较轻,病理评分显著低于"PBS组”。外周血涂片及骨髓穿刺细胞学涂片提示“高剂量5-FU组”骨髓增生程度较"PBS组”明显减低,而“低剂量5-FU组”与"PBS组”比较无明显差异。3. CD4+CD45RBhiT细胞转移种植模型小鼠5-6周后出现体重下降趋势。“低剂量5-FU组”出现体重减轻较"PBS组”较晚,体重减轻幅度较小,肠道组织大体及镜下炎症程度较轻,病理评分显著低于"PBS组”。肠系膜淋巴结单细胞悬液流式染色显示“低剂量5-FU组”的小鼠产生IL-17A及IFN-Y的CD4+T细胞显著低于"PBS组”。Q-PCR结果显示“低剂量5-FU组”的小鼠IL-17A及IFN-γ mRNA水平显著低于"PBS组”。磁珠分选WT小鼠脾脏和肠系膜淋巴结的CD4+T细胞,体外培养加相应的细胞因子往Th1、Th17及Treg方向极化。流式细胞术显示当5-FU剂量降至0.5μM时,Th1、Th17的相应细胞因子IFN-γ、IL-17A较对照组仍显著降低,而Treg相应的转录因子Foxp3无明显变化。Western Blot结果显示Th1、Thl7的相应转录蛋白T-bet及RORΓT蛋白表达水平较对照组也显著降低,ELISA显示Thl、Th17细胞上清中IFN-γ、IL-17A水平较对照组仍显著降低。Q-PCR显示IFN-γ、IL-17AmRNA水平较对照组显著降低,而Foxp3mRNA水平无明显差异。提取WT小鼠肠道固有层淋巴细胞LPL,在5-FU (0.5μM)作用下体外往Th0和Th17方向极化培养48h.采用PMA/ionomycin刺激细胞5小时后流式染色上机检测产生IL-17AT细胞的表达。结果提示低剂量5-FU (0.5μM)显著抑制小鼠肠道LPL中Th17细胞的表达。4.293T细胞转染RORΓT、STAT3、T-bet及HA-UB等重组质粒,Western Blot结果显示低剂量的5-FU即可降低RORyT、STAT3、T-bet蛋白表达水平。荧光素酶检测(Luciferace)结果显示5-FU抑制RORyT与IL-17启动子结合呈剂量依赖性。5.染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, Chip assay)结果显示5-FU剂量为1μM时Thl细胞STAT4与IFN-γ、T-bet启动子结合和Th17细胞中STAT3与RORyT及IL-17的启动子结合水平较对照组显著降低。结论大剂量的短期5-FU化疗可显著降低病人肠道组织Thl和Th17相关细胞因子及转录蛋白,提示5-FU可能降低病人肠道组织中Thl和Th17的表达。在化学和免疫IBD动物模型中,低剂量5-FU显著延缓肠炎的发生发展,通过抑制Thl细胞中STAT4与IFN-γ、T-bet启动子结合和Th17细胞中STAT3与RORyT及IL-17的启动子结合而下调小鼠体内Thl和Th17相关细胞因子及转录蛋白的表达,可能是其发挥抗炎、肠道保护的免疫机制。