阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),又称老年痴呆,是一种慢性、原发性中枢神经系统退行性疾病。临床表现以进行性认知功能障碍和学习记忆能力丧失为主要特征,晚期将出现严重的痴呆。AD最典型的病理特征之一就是脑内出现高密度的以淀粉样p蛋白(amyloid protein, Aβ)为核心的老年斑。Ap是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)在β分泌酶和γ分泌酶的作用下水解生成的。AD病变主要累及脑内与学习和记忆等涉及认知功能的相关区域,尤其是海马和颞叶皮层。目前,关于Ap的神经毒性作用已有广泛报道。无论在体还是离体研究都表明：Aβ能够引起动物空间学习和记忆行为受损、脑内神经突触可塑性降低和培养的神经细胞凋亡等。因此,AD发病机制的“Ap学说”已被广泛认可。然而,由于Aβ的神经毒性作用所涉及的细胞机制和分子机制比较复杂且未被详细阐明,迄今为止对抗Ap的药物研究仍然没有突破性进展。寻找有效拮抗Aβ神经毒性作用的药物,已成为治疗AD的一个关键所在。值得注意的是,已有大量流行病学调查显示,另一种与年龄相关的退行性疾病—II型糖尿病(type2diabetes mellitus, T2DM)与AD有着极其密切的相关性,表现为：两种疾病在发病过程、病理变化和临床表现等方面均有着高度惊人的相似性。由此,近年来提出一个治疗AD的新策略和新思路就是：利用控制T2DM的药物来减少Aβ的产生和聚集、增强Ap的降解和清除以及拮抗Ap的神经毒性,从而达到预防和治疗AD的效果。胰高血糖素样1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种促胰岛素分泌的激素。由于GLP-1能够以葡萄糖依赖性的方式发挥促进胰岛素分泌的作用,所以不会引起正常人血糖水平的改变。正是因为这个优点,GLP-1已成为目前治疗T2DM的最新型和最有潜力的药物。有趣的是,GLP-1及其受体(glucagon-like peptide-1receptor, GLP-1R)也表达于脑内很多的与认知功能相关的区域,尤其是海马。特别是已有实验证实,GLP-1能够降低脑内的Ap水平,抵抗细胞凋亡和发挥神经营养因子样的作用。然而,目前为止,GLP-1的神经保护作用仍缺乏完整的在体实验证据；GLP-1能否拮抗Ap引起的认知功能障碍,能否逆转Aβ引起的海马突触可塑性损伤目前仍不清楚；GLP-1发挥神经保护作用所涉及到的可能机制也有待深入研究；尤其是,由于天然的GLP-1可被二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase-4, DPPIV)裂解,故半衰期仅有1～2min,这使得GLP-1在AD治疗中的应用受到了极大限制。Lixisenatide是一种新型的GLP-1类似物,它不仅能够抵抗DPPIV的裂解,使得半衰期较长,而且与GLP-1R的亲和力是天然GLP-1的4倍,生物活性较高。因此,本研究系统探讨了GLP-1类似物Lixisenatide的神经保护作用及可能机制。研究主要分为以下三个部分：(1)采用Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)技术,观察双侧海马内注射lixisenatide,是否可以有效拮抗Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力的障碍；(2)采用在体大鼠海马CA1区场电位的电生理技术,观察了双侧海马内注射lixisenatide是否可以有效逆转Aβ25-35引起的长时程增强(Long term potentiation, LTP)的压抑；(3)采用Western Blotting分子生物学手段,观察了lixisenatide对PI3K-AKT信号转导通路中糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase3β, GSK3β)活性的影响,旨在阐明lixisenatide发挥神经保护作用的分子机制。第一部分Lixisenatide保护大鼠空间学习记忆免受Aβ25-35引起的损伤为了阐明lixisenatide在脑内是否能够发挥神经保护作用,我们采用Morris水迷宫(MWM)行为学方法观察了双侧海马内注射lixisenatide对Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力障碍的影响。实验选用反应灵活、无视觉和运动障碍的雄性Sprague Dawley (SD)大鼠。SD大鼠被麻醉后,在脑立体定位仪的引导下,应用微量注射泵将药物缓慢注入双侧海马内。待大鼠清醒并恢复约两周后,进行MWM行为学测试。该测试分三部分进行：定位航行实验、空间探索实验和可视平台实验。主要观察指标为：大鼠逃避潜伏期和游泳距离、大鼠在目标象限(即平台所在的象限)内游泳的时间和距离占总时间和总距离的百分比、大鼠游泳速度以及大鼠寻找可视平台的潜伏期。实验结果显示：(1)Aβ25-35能够显著降低大鼠的空间学习和记忆能力。双侧海马内注射5nmol Aβ25-35后,在定位航行实验中,与对照组相比,从开始测试后的第2天到第5天,大鼠寻找目标平台的时间和游泳距离明显延长(P<0.05)。例如,在训练第4天时,5nmol Aβ25-35处理组大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离分别为23.02±1.95s和452.90±26.31cm,明显多于对照组的16.43±1.67s和214.05±39.61cm(P<0.05)。在第6天的空间探索实验中,5nmolAβ25-35处理组的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为25.30±3.85%和25.97±3.63%,明显少于对照组的46.24±4.59%和45.71±4.25%(P<0.05)。(2)单独给予1ixisenatide对大鼠的空间学习和记忆能力的影响没有统计学差异。在定位航行实验中,5nmol lixisenatide不影响大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离,与对照组相比,没有明显的统计学差异(P>0.05)；在空间探索实验中,5nmol lixisenatide处理组的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比分别为44.78±4.32%和45.46±3.47%,与对照组的46.24±4.59%和45.71±4.25%相比,也没有明显的统计学差异(P>0.05)。(3) Lixisenatide以剂量依赖性的方式保护了Aβ25-35诱发的大鼠空间学习和记忆能力的损伤。在定位航行实验中,低剂量lixisenatide处理组(0.05nmol)的大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离与单独给予5nmol Aβ25-35处理组相比,无显著的统计学差异(P>0.05)；中等剂量lixisenatide处理组(0.5nmol)和高剂量lixisenatide处理组(5nmo1)的大鼠的逃避潜伏期和找到目标平台所游过的距离与单独给予5nmol Aβ25-35处理组相比,有显著的统计学差异(P<0.05)。在训练第4天,0.5nmol和5nmol lixisenatide+5nmol Aβ25-35处理组的大鼠的逃避潜伏期分别为：18.09±1.17s和14.78±1.13s；大鼠找到目标平台所游过的距离分别为：326.45±25.95cm和226.41±25.50cm,且呈现出一定的剂量依赖性趋势(P<0.05)。在空间探索实验中,低剂量lixisenatide处理组(0.05nmol)的大鼠处于目标象限的时间和距离占游泳总时间和总距离的百分比与单独给予5nmol Aβ25-35处理组相比,无明显的统计学差异(P>0.05)。0.5nmol和5nmo1lixisenatide处理组的大鼠处于目标象限的时间占游泳总时间的百分比分别为：34.38±3.11%和42.22±3.33%；大鼠处于目标象限的距离占游泳总距离的百分比分别为：35.14±3.99%和44.42±3.41%,明显高于单独给予5nmol Aβ25-35处理组(P<0.05),且随着lixisenatide浓度的增加而逐渐增大,表现出明显的剂量依赖性(P<0.05)。(4)可视平台实验显示：lixisenatide、Aβ25-35以及二者的联合应用均未影响大鼠的运动能力和视力。各组大鼠的游泳速度没有明显的统计学差异(P>0.05),基本维持于22cm/s左右。各组大鼠寻找可视平台的时间也没有明显的统计学差异(P>0.05),基本维持于15s左右。以上实验结果表明：双侧海马内注射Aβ25-35严重损害了大鼠的空间学习和记忆能力；lixisenatide能够剂量依赖性有效拮抗Aβ25-35引起的学习和记忆能力损伤。从而提示：脑内GLP-1的高表达,尤其是使用GLP-1类似物lixisenatide极有可能成为治疗AD等神经退行性疾病的一种新思路和新方法。第二部分：Lixisenatide保护大鼠在体海马长时程增强免受Aβ25-35引起的损伤本实验采用神经电生理学方法,通过记录大鼠在体海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)观察了双侧海马内注射Aβ25-35和lixisenatide以及二者的联合应用对大鼠海马CA1区长时程增强(LTP)的影响作用,旨在阐明lixisenatide的神经保护作用以及探讨lixisenatide发挥神经保护作用的电生理学机制。实验采用MWM行为学测试后的大鼠,将其麻醉后固定在脑立体定位仪上,然后将绑定电极(同心圆双极刺激电极和单极记录电极)精确插入到海马的刺激部位和记录部位。通过给予海马Schaffer侧枝单个测试刺激、双脉冲刺激和—组高频刺激(high frequency stimulation, HFS)后,在海马CA1区的放射层记录基础的fEPSP、双脉冲刺激引起的双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)和HFS引起的LTP。实验结果显示：(1)双侧海马内注射Aβ25-35不影响基础fEPSP的幅度,但显著抑制了HFS引起的海马在体LTP。注射5nmol Aβ25-35后,fEPSP的平均幅度在HFS后的30min和60min时分别为：136.66±3.41%(P<0.01)和119.01±3.82%(P<0.01),明显低于对照组的168.13±3.16%和155.65±3.48%,表现出显著的LTP抑制效应。(2)单独给予lixisenatide对基础fEPSP的幅度和HFS后引起的LTP均没有影响,与对照组相比,无明显统计学差异(P>0.05)。(3)不同浓度的lixisenatide剂量依赖性拮抗了Aβ25-35诱导的LTP损伤。HFS后的1h,三个不同浓度(0.05nmol,0.5nmol和5nmo1)的lixisenatide+5nmol Aβ25-35处理组的fEPSP幅度分别为120.84±3.77%(P>0.05)、135.70±3.80%(P<0.01)和145.71±3.81%(P<0.01)。0.5nmol和5nmol lixisenatide+5nmol Aβ25-35处理组的fEPS的幅度均明显高于单独给予5nmol Aβ25-35处理时的fEPSP的幅度(P<0.01),且随着lixisenatide浓度的升高,Aβ25-35引起[的LTP的压抑效应逐渐改善,呈现出一定的剂量依赖性(P<0.05)。(4)各组的PPF没有明显的统计学差异(P>0.05),说明各种药物对LTP的影响主要不是通过突触前机制进行的。以上电生理实验结果表明：双侧海马内注射Aβ25-35严重压抑了大鼠海马CA1区的LTP; lixisenatide可以剂量依赖性有效逆转Aβ25-35引起的在体大鼠海马CA1区LTP的抑制。可见,Lixisenatide对大鼠海马LTP的保护效应与lixisenatide对大鼠学习和记忆能力的保护作用是一致的,这在一定程度上解释了GLP-1和GLP-1类似物lixisenatide改善大鼠认知功能的细胞机制。第三部分：Lixisenatide抑制Aβ25-35诱导的糖原合成酶激酶3β的激活Lixisenatide的神经保护作用可能与PI3K-AKT-GSK3P信号转导通路有关。为了研究lixisenatide对抗Aβ引起的认知功能和长时程增强的损伤而发挥神经保护作用的分子机制,我们观察了lixisenatide和Aβ25-35处理对糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase3β, GSK3β)活性的影响。电生理实验结束后,大鼠的海马组织被取出,立即将其制备成Western Blotting分子技术检测的样品。我们检测了GSK3p及其两种磷酸化形式pGSK3β (S9)和pGSK3β (Y216)的活性水平,并计算了GSK3β/β-actin, pGSK3p (S9)/GSK3p和pGSK3β (Y216)/GSK3β的比值。实验结果显示：(1)对照组、5nmol Aβ25-35处理组、5nmol lixisenatide处理组和5nmol lixisenatide+5nmol Aβ25-35处理组的GSK3β/β-actin的比值分别为：1.41±0.07、1.40±0.05、1.40±0.05和1.41+0.06。各组之间没有明显的统计学差异(P>0.05)。(2)5nmolAβ25-35处理组的pGSK3β (S9)/GSK3β比值是0.38±0.06,明显低于对照组的0.53±0.06(P<0.05)。单独给予5nmol lixisenatide处理不影响pGSK3β (S9)/GSK3p)比值P>0.05),但联合应用5nmol lixisenatide和5nmolAβ25-35后,该比值为0.52±0.05,明显高于单独给予5nmol Aβ25-35处理时的比值(P<0.05)。说明lixisenatide能够拮抗Aβ25-35引起的pGSK3p (S9)/GSK3p)比值降低,从而抑制GSK3β的活性。(3)5nmol Aβ25-35处理组的pGSK3β(Y216)/GSK3p比值是0.51±0.05,明显高于对照组的0.35±0.07(P<0.05)。单独给予5nmol lixisenatide处理不影响pGSK3β (Y216)/GSK3β比值(P>0.05)。但是,5nmol lixisenatide预处理后,该比值为0.36±0.06,明显低于单独给予5nmolAβ25-35处理组(P<0.05)。说明lixisenatide能够拮抗Aβ25-35引起的pGSK3β(Y216)/GSK3β比值升高,从而抑制GSK3β的活性。以上实验结果表明：lixisenatide可以有效对抗Aβ25-35诱导的GSK3β的激活,从而发挥拮抗空间学习和记忆损伤及逆转长时程增强压抑的神经保护作用。该结果提示：PI3K-AKT-GSK3β信号转导通路中GSK3p活性的降低很可能是GLP-1及其类似物lixisenatide发挥神经保护作用的重要分子机制。综上所述,本研究利用Morris水迷宫测试、电生理场电位记录和Western Blotting技术,通过观察大鼠空间学习和记忆能力、记录在体海马LTP和检测PI3K-AKT信号转导通路中GSK3β的活性水平,阐明了lixisenatide拮抗Aβ25-35的神经毒性作用及发挥神经保护作用的细胞机制和分子机制。研究结果表明,lixisenatide能够有效对抗Aβ25-35诱导的大鼠空间学习和记忆能力障碍及在体海马LTP损害,此种神经保护作用可能与lixisenatide对突触传递的调控以及对GSK3β活性水平的影响有着紧密的联系。因此,本研究为GLP-1类似物lixisenatide的神经保护作用提供了可靠的行为学和电生理学证据,并初步揭示了可能的细胞和分子机制,为GLP-1类似物lixisenatide用于AD的临床治疗奠定了一定的实验基础。