金粟兰AP1CHL基因功能的研究

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高等植物的开花是其生命周期中的一个重要转折期,因而花的形成和发育一直为生物学家所关注。控制花发育的基因主要有两类:花分生组织决定基因和花器官特性基因(即同源异型基因)。花分生组织决定基因促进花序分生组织产生花分生组织并进一步分化产生花器官原基,但产生何种花器官则是由同源异型基因所控制的。 MADS-box基因在植物花发育的分子遗传调控过程中起着关键性的作用,它们多数是由M、I、K和C四个区域构成的,很少一些MADS-box基因在M区上游还具有一段富含碱性氨基酸的N末端区域。其中M区高度保守,它编码真核生物转录因子的DNA结合域,具有DNA结合和二聚体形成的作用。经典的“ABC”模型中所涉及的MADS-box基因有A、B、C三类功能,随后“ABC”模型不断得到充实和完善,D类和E类功能基因的出现壮大了MADS-box基因家族,“ABCD”模型、“ABCDE”模型和“四聚体”模型相继涌现,使人们对花发育的机理有了更深入的了解。 金粟兰在系统分类地位上是属于金粟兰科金粟兰属。该类群是现存的具有化石的早期的基部被子植物之一,其花无花被。在被子植物系统分类中,花器官的简化曾被认为是一种衍生性状。但是近年来的化石资料显示,类似于金粟兰类植物的小而结构简单的花出现在木兰类大而复杂的花之前。因此,金粟兰的形态学特征、系统发育和分类地位对于解决花被的起源,并进而探索花的起源有着重要的意义。 本论文对本实验室从阔叶金粟兰[Chloranthus spicatus(Thunb.)Makino]克隆的一个MADS-box基因——AP1CHL基因进行了烟草转基因分析。BLAST和Phylogenetic分析表明该基因属于A类基因亚族。通过限制性内切酶切割和连接反应,构建该基因的正义、非全长反义和全长反义表达载体,并置于CaMV35s启动子的驱动之下。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.,W38)、组织培养再生植株,然后经生根培养的抗生素筛选、PCR鉴定,筛选出可能的阳性植株并将其移栽到温室。CTAB法提取成株基因组DNA,做Southern blotting检测,测定其中的AP1CHL基因的拷贝数(这一步骤正在进行中)。转化烟草的同时,利用农杆菌介导的浸渍法转化拟南芥(Columbia ecotype),得到T0代种子,将种子干燥后,于4℃放置两周,再于加有50mg/l的Kan的1/2MS上筛选阳性植株,目前这一步她在进行当中。 通过对于转基因烟草的表型的观察,发现反义转基因烟草花萼、花冠和雄蕊的数目发生改变,表明该基因可能参与了花萼、花冠和雄蕊原基特性的决定过程。上述结果与A类基因的功能特异性——既是花分生组织决定基因又是花器官决定基因相一致。
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