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实验目的 膀胱逼尿肌活动亢进是下尿路症状的常见原因，临床上表现为尿频、尿急和急迫性尿失禁，是膀胱储尿功能障碍的表现。最近研究发现，肾上腺素能β受体（β-adrenoceptor，β-AR）亚型能够介导膀胱平滑肌松弛，对维持储尿过程中膀胱良好的顺应性起着关键作用。但究竟哪一种β-AR亚型介导逼尿肌松弛，国内外学者还有一定的争论。为进一步探讨β-AR亚型在逼尿肌中功能奠定基础，我们拟采用反义基因（antisense）技术，构建β-AR亚型的反义真核表达载体，封闭三种β-AR中的任意两个，得到表达单一亚型的细胞克隆，再进一步进行研究，以确定β-AR激活对逼尿肌细胞的松弛和增殖的影响，并为寻找新的最终解决膀胱逼尿肌活动亢进的治疗方法提供理论依据。 实验方法与方法 一、人膀胱逼尿肌中β2-AR全长基因的克隆：称取冰冻状态下的膀胱逼尿肌组织约200mg，采用宝生物公司的Trizol试剂并按使用说明书操作提取总RNA，1％低熔点琼脂糖凝胶鉴定RNA的含量及完整性。根据Genebank提供的β2-AR基因序列（NM000024）采用Oligo6.6软件设计如下两对引物，外引物及内引物，应用套式PCR来扩增目的基因。 内引物：上游引物： 下游引物：CAThTG-3’外引物：上游引物：5’－TGCGCTTACCTGCCAGACTG－3’ 下游引物：5’－GCCCTTCCTTCTGCATATCTC－3’ 其中内引物是针对蛋白质编码区（CDS：220－1461bp）设计的，其上游加有BarnHI及Q 酶切位点，下游加有Hindlll位点，使其能反向连接在PLNCX的多克隆位点上。外引物FDZ，R02可扩增 p－AR CDNA第 194－1587hp。弓物由大连宝生物公司合成。取总 RNA lgl采用宝生物公司的 RNA LA PCR”kit（AMV）试剂盒进行 RT－PCR反应。反应条件：RT 30t 10ndn、42t45minaps℃5 dn一4℃保存；PCR 94℃ lmin一98℃ 10s，55℃305，72℃l分15秒，35个循环一4t保存。取sgl扩增产物用1％琼脂糖凝胶跑电泳，并用 BIO－RAD FISS凝胶图像处理系统进行图像分析。 二小－AR基因反义真核表达载体的构建KR产物用 1％琼脂糖凝胶跑电泳除杂质，并用柱式PCR产物回收试剂盒回收。回收产物与pUC18克隆载体分别用BamHI和Hindlll酶切后在T4－DNA连接酶的作用下16t过夜连接。取连接产物转化感受态大肠杆菌JM109，涂布含有氨苦青霉素、IPIG和X－吵的平板，37t过夜培养，挑取白色菌落并作标记，通过菌落PCR鉴定阳性重组克隆。将含有阳性重组质粒的菌落挑人适量LB培养液中，37℃培养过夜，采用GibCO公司的质粒提取试剂盒制备质粒，一部分作 BamHI＋Hindlll双酶切鉴定正确后将其命名为 pUC－民－AR；一部分用Q＋Inndlll双酶切后，二％琼脂糖凝胶回收 1．2［目的基因；随后用0＋Hindlll双酶切逆转录病毒载体 plncx，并用 Q吨en公司的 QIAtwck Gel whon it后回收 plnx经酶切后所产生的载体片段，经T4—DNA连接酶连接目的基因及载体片段＊℃水浴过夜连接入摇菌扩增，提取质粒后，用＊＋Hindlll双酶切进行电泳鉴定。插人片段的碱基序列及其插人方向采用 ·2·DNA测序方法进行鉴定(由大连宝生物公司鉴定人鉴定正确后将民－＊R反义真核表达载体命名为P LNLN0X－民－＊R。 实验结果 二．目的基因的克隆：反转录产物经 PCR扩增＊％琼脂糖凝胶电泳显示RT－PCR结果与预期长度一致O．Zkb人 2·PMCX－p。－AR反义表达载体的酶切鉴定，其结果与理论设计完全相符。 3·PLNCX－P。－AR载体中目的基因的碱基序列及其插人方向的鉴定：测序结果显示我们所克隆进人PhCX的目的片段其碱基序列与Genebank所提供的p。－AR的碱基序列完全一致，且插人方向完全正确，表明我们已经成功构建了人膀腕逼尿肌肾上腺素能民受体基因的反义真核表达载体。 结 论 经酶切鉴定和序列分析，本实验所克隆的p－AR全长CDNA序列与Genbank上报道的完全一致且插人载体的方向也完全正确，重组病毒载体PlnCX－p－AR经双酶切鉴定，释放出＊Zkb的片段，说明p－AR逆转录病毒反义真核表达载体已构建成功，这就为下一步p－AR亚型功能的研究奠定了基础。