论文部分内容阅读
背景肿瘤在发展过程中会发生免疫逃避机制,例如诱导各种免疫抑制细胞,进而抑制有效的免疫反应。研究表明,血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor,VEGF-A)除了具有促血管生成活性外,还具有免疫抑制作用,并且这些免疫抑制功能主要通过VEGF-A/VEGFR2通路作用。靶向VEGFR2的VEGF单抗和受体抑制剂已被证实可以改善肿瘤免疫抑制。作为一种抑制血管生成VEGF异构体,VEGF165b显示为一种有效的抗肿瘤药物,但是其在肿瘤免疫调控的作用尚待研究。目的获得突变后的VEGF165b蛋白,延长其药物半衰期,并保留其药物活性。验证突变型VEGF165b对小鼠黑色素瘤的抑制效果,并且验证其对肿瘤引起的一系列免疫抑制细胞的影响,同时比较其与酪氨酸酶抑制剂(舒尼替尼)的应用效果。方法将VEGF165b的酶裂解位点进行突变后,验证质粒的正确性,转入载体pPIC9K中,通过电转的方式整合到酵母细胞GS115染色体基因组中,然后通过高浓度的G418平板对高拷贝阳性克隆进行筛选;将筛选出的高拷贝菌株用甲醇诱导的方式进行外源蛋白的表达,并对含有目的蛋白的发酵液上清用琼脂糖肝素亲和柱进行纯化,获得突变后的VEGF165b蛋白样品(以下简称mVEGF165b)。通过SDS-PAGE和Western blot分别验证蛋白的纯度和性质。并通过内皮细胞增殖实验,检测mVEGF165b的蛋白活性。然后分别在动物实验中,用m VEGF165b蛋白对荷瘤小鼠进行治疗,验证其对免疫抑制细胞MDSCs和Tregs的影响,以及对小鼠免疫机制的调控。在体外实验中,将荷瘤小鼠脾脏内Tregs用免疫磁珠分选,验证mVEGF165b对Tregs的分裂增殖的影响。为进一步验证mVEGF165b对Tregs的抑制,选用eGFP-Tregs转基因模型鼠,验证其对荷瘤鼠血液循环中Tregs的影响。结果1.成功构建并筛选突变型VEGF165b(mVEGF165b)高表达酵母菌株;2.甲醇诱导蛋白表达并纯化出mVEGF165b蛋白,SDS-PAGE及Western blot实验对蛋白进行验证;3.细胞水平证明与标准品蛋白相比,mVEGF165b有较好的活性,对VEGF165介导的内皮细胞增殖有抑制;4.通过mVEGF165b连续给药,小鼠黑色素瘤的生长受到抑制;5.经过两周m VEGF165b治疗,与未治疗荷瘤小鼠相比,治疗后小鼠脾脏与肿瘤内MDSC细胞的比例和数量下降约3倍;6.同样,经过两周mVEGF165b治疗,与未治疗荷瘤小鼠相比,治疗后小鼠脾脏与肿瘤内Treg细胞的比例和数量下降约1.5倍;7.mVEGF165b治疗后,荷瘤小鼠脾脏内免疫细胞CD5~+T、CD8~+T比例上升,回归正常小鼠水平;8.体外实验中,将荷瘤小鼠脾脏内Treg细胞分离培养,加mVEGF165b刺激,Treg细胞分裂增殖被抑制3倍;9.对肿瘤相关巨噬细胞,RAW264.7,mVEGF165b可以抑制细胞增殖;10.用eGFP-Treg基因敲入鼠进一步证实,mVEGF165b可以使肿瘤引起的脾脏和肿瘤内Treg细胞的比例和数量下降2倍。结论1.给药治疗后mVEGF165b对小鼠黑色素瘤有较强的抑制作用,因此mVEGF165b可以作为一种天然抗癌药物。2.mVEGF165b降低黑色素瘤引起的小鼠免疫抑制细胞MDSCs、Tregs的比例,并且提高CD4~+T和CD8~+T细胞比例。因此mVEGF165b可以作为一种调节免疫抑制的药物。