【研究背景】人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）是一种线状双链DNA病毒,属疱疹病毒β亚科,在人群中感染率高。在健康人群,通常呈无症状或潜伏感染,但在免疫缺陷或抑制个体则易引发HCMV相关疾病。HCMV具有独特的与宿主相互作用模式,大量研究表明,多种类型免疫细胞参与宿主抗HCMV免疫应答反应,例如树突状细胞（dendritic cells,DCs）、自然杀伤细胞（natural killer,NK）和T细胞等,共同参与限制病毒原发感染与抑制潜伏病毒活化。CD11c,即整合素蛋白αx,可与整合素β2链蛋白（CD18）形成异二聚体,主要参与细胞黏附、迁移和吞噬等过程。因CD11c高表达于DCs表面,常被用作DCs的特异性标志。但NK细胞、T细胞、单核细胞和巨噬细胞等多种免疫相关细胞也有不同程度的CD11c表达。近年来的多项研究发现,CD11c不仅能作为细胞识别标志,还可能与各种免疫细胞的活化和效应功能相关。由此推测,在小鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus,MCMV）感染模型中,各种免疫细胞具有独特的CD11c表达模式,且这种表达模式的差异可能与MCMV对BALB/c（易感和易慢性化）和C57BL/6（非易感和急性自限）鼠系的致病性差异和不同感染结局之间存在一定相关性。HCMV还是引起先天性感染的常见病毒,影响儿童的神经发育和远期健康。而先天性HCMV感染多是源于母体孕期原发感染或潜伏感染活化。近年来众多流行病学证据表明,母体孕期感染与子代神经精神障碍性疾病例如自闭症和精神分裂症之间存在着明确的关联。其中,孕期HCMV感染就是子代自闭症的高危因素之一。进一步的动物学研究证明,孕期感染所致的母体免疫激活（maternal immune activation,mIA）状态是导致子代精神行为异常发生的主要原因。而mIA是通过何种方式影响子代神经精神发育,其机制目前还尚未明确。血清素（serotinin）或称5羟色胺（5-HT）,作为一种营养生长因子,在早期发育阶段能够参与多种与神经系统发育相关的重要过程。而胎盘作为母胎交界面重要的物质交换和免疫脏器,是早期胎儿前脑5-HT的主要提供者。因此,任何改变胎盘5-HT合成和代谢的母体因素都有可能间接的影响子代神经精神发育。且已有动物研究证实,病毒模拟感染所致的母体炎症能够增强胎盘向胎脑的5-HT输送,从而影响胎儿前脑的5-HT能神经元分布。可以推测,孕期MCMV感染同样可以导致母体免疫激活,并引起胎盘和胎脑5-HT合成和代谢的异常。同时,由于小鼠与人胎盘结构存在一定的差异,MCMV无法通过小鼠胎盘感染胚胎,从而天然的排除MCMV感染对子代胎脑的直接影响,可以作为研究母体免疫激活对子代影响更为有利的模型。【目的】1.利用小鼠播散性MCMV感染模型,测定病毒感染后肺组织细胞CD11c和特异性表面标记的表达,以分析各种免疫细胞独特的CD11c表达模式;进一步对比观察BALB/c和C57BL/6两种鼠系的差异性,以寻找CD11c表达模式与免疫细胞功能以及MCMV慢性化之间的潜在关系。2.建立孕前和孕期MCMV感染小鼠模型,评定胎盘和胎脑重量改变,并测定胎盘母体免疫激活相关细胞因子基因转录水平,以明确MCMV感染所致母体免疫激活与子代神经精神异常的潜在相关性;测定胎盘和胎脑血清素合成和代谢通路各关键酶,并观察胎盘组织血清素表达及其改变,以明确MCMV相关mIA对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响。【方法】第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式1.小鼠播散性巨细胞病毒感染模型的建立:雌性BALB/c小鼠,4.5周龄,腹腔接种MCMV Smith毒株（5×10³）PFU,建立播散性感染模型,同时设立正常对照组;同步设置C57BL/6小鼠MCMV感染组及其正常对照组;2.收获MCMV感染后1、3、5、7天各组小鼠肺组织,制作单细胞悬液,抗体标记CD11c和其他特异性细胞表面分子,流式细胞学检测法测定各组CD11c阳性表达细胞;同时收集各组小鼠外周血和脾脏单个细胞悬液,分析自然杀伤细胞（NK）和T细胞表面的CD11c表达模式。第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响1.建立BALB/c小鼠孕期急性巨细胞病毒感染模型（acute MCMV infection druing pregnancy,a-MCMV）,同时设立孕前巨细胞病毒感染组（pre-pregnancy MCMV infection,p-MCMV）、LPS对照组（LPS）和正常对照组。其中,LPS对照组分设高中低三个剂量亚组,分别注射50μg/kg、25μg/kg和1.5μg/kg的LPS;2.自孕栓检出日为胚胎日龄（embryonic day,E）第0.5天,即E0.5d;于E13.5d、E14.5d及E18.5d收集小鼠胎盘和胎脑组织,评估各实验组胎盘和胎脑组织均重;胎盘组织石蜡包埋,H&E染色评估其病理学改变;3.分别提取胎盘和胎脑组织总RNA,逆转录为cDNA,并采用荧光定量PCR方法测定各实验组母体免疫激活相关细胞因子IL-6和IL-10,胎盘血清素合成和代谢通路关键酶TPH1、DDC、Mao-A和转运蛋白SERT,以及胎脑血清素合成和代谢关键酶TPH2和转运蛋白SERT的mRNA表达动态变化;4.收集各组E13.5d胎盘组织,石蜡包埋,采用免疫荧光法测定其血清素（5羟色胺,5-HT）表达及组织分布。【结果】第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式1.CD11c^int细胞群的流式细胞学鉴定:由于前期研究于MCMV感染后7天（7dpi）观察到肺组织显著增多的CD11c表达量中等细胞群(CD11c^intMHC II^-/loCD86^-/lo)。为了对其进行鉴定,采用NKp46、CD3ε、CD19、Ly6G、F4/80和Siglec H分别标记NK cells、T cells、B cells、中性粒细胞、巨噬细胞和浆细胞样DCs（pDCs）。结果显示,正常组CD11c^int细胞群主要由NK cells（NKp46⁺CD3ε^-）和T cells（CD3ε⁺NKp46^-）构成;MCMV感染后肺组织CD11c^intT细胞大量扩增,构成7dpi主要的CD11c^int细胞群;而CD11c^intT细胞经进一步标记确定为CD8a⁺细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）;2.肺组织MCMV特异性CD8⁺T细胞分析:MCMV感染后7天,约10%的CD8⁺T细胞为MCMV-m164特异性细胞（正常组低于1%）;几乎所有的tetramer⁺CD8⁺T细胞（即MCMV-m164特异性T细胞）均为CD11c^int细胞;3.肺组织T细胞的CD11c表达模式及其在BALB/c和C57BL/6两种不同近交系小鼠中的比较:CD4⁺T细胞在MCMV感染前后均为CD11c无表达或低表达;而CD8⁺T细胞（CTLs）由CD11c^-和CD11c^int两个亚群组成。正常组,CD11c^-细胞占CTLs的绝大多数（C57BL/6比例稍高于BALB/c,约90%vs 80%）;MCMV感染后C57BL/6和BALB/c均能观察到CD11c^intCTLs的显著增多（可占到80%⁸5%）;而C57BL/6能够诱导更高水平（占肺组织总细胞含量的40%⁵0%vs BALB/c 20%³0%）的CTLs扩增(主要是CD11c^intCTLs的扩增);4.脾脏和外周血CTLs的CD11c表达模式:MCMV感染均能诱导感染后7天脾脏和外周血CD11c^intCTLs的显著扩增,且C57BL/6可诱导更为剧烈的CTLs扩增;5.NK细胞的CD11c表达模式及其在BALB/c和C57BL/6两种不同近交系小鼠中的比较:NK细胞由CD11c^-和CD11c^int两个亚群组成;（1）BALB/c小鼠:正常组,CD11c^-细胞构成了肺NK细胞的主要亚群（约65%⁷0%）;MCMV感染后7天,CD11c^-NK细胞百分含量减低,而CD11c^intNK细胞仅少量减低,后者构成感染后NK细胞的主要亚群;（2）C57BL/6小鼠:在未感染情况下,CD11c^intNK细胞是肺NK细胞的主要亚群（⁷5%）,而MCMV感染后,几乎所有的NK细胞均为CD11c^int细胞（>95%）;6.BALB/c和C57BL/6两种近交系小鼠NK细胞独特的CD11c和B220表达模式:（1）BALB/c小鼠:B220^-CD11c^-构成正常组NK细胞的主要亚群,其次是B220^-CD11c^int;MCMV感染后B220^-CD11c^int逐渐成为NK细胞主要构成,同时NK细胞上调B220的表达,从而使B220⁺CD11c^int细胞在3⁵ dpi出现少量增多;（2）C57BL/6小鼠:B220^-CD11c^int在未感染前是构成NK细胞的主要亚群,MCMV感染后显著上调B220的表达,从而使B220⁺CD11c^int细胞亚群在3dpi达峰（⁴0%,显著高于BALB/c）;7.BALB/c和C57BL/6小鼠NK细胞表面NKp46表达水平比较:MCMV感染可以显著减低NK细胞表面NKp46表达水平;BALB/c的NKp46表达高于C57BL/6。第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响1.胎盘和胎脑均重分析:与正常组相比,孕期急性MCMV感染和50μg/kg LPS刺激均可导致胎盘和胎脑重量的显著减低。LPS低剂量组（25μg/kg和1.5μg/kg）组织重量减低情况较LPS 50μg/kg组轻微。p-MCMV组未观察到显著的组织重量减轻,E18.5d胎盘重量甚至高于正常组;2.胎盘组织病理学分析:LPS组和MCMV组（含a-MCMV和p-MCMV组）均可观察到不同程度的炎症改变,以E13.5d为甚。在LPS 50μg/kg组,主要的病理改变是坏死,部分坏死灶可伴有出血。而a-MCMV组,除了坏死之外,还可在交界区观察到炎症细胞的浸润。p-MCMV组仅见轻微的坏死改变。E18.5d时LPS50μg/kg组表现出迷路区血管密度和分支程度的显著降低,而a-MCMV组血管密度仅略有下降;3.胎盘母体免疫激活相关细胞因子IL-6和IL-10的mRNA表达:孕期急性MCMV感染可以导致E13.5d胎盘IL-6转录水平的显著上调（相较于正常组,P<0.05）,于24小时后恢复到正常水平。相反,LPS 50μg/kg组在E13.5d和E14.5d可观察到IL-6 mRNA水平的下调,其中,E14.5d显著低于正常组（P<0.05）。各实验组各时间点胎盘IL-10的mRNA水平相对稳定;4.胎盘血清素代谢通路的改变:孕期急性MCMV感染可以显著上调胎盘各时间点血清素合成酶TPH1和DDC的基因表达,而不改变血清素降解酶Mao-A以及转运蛋白SERT的表达。LPS 50μg/kg组可以短暂上调E13.5d胎盘TPH1和DDC的转录水平,同样不影响Mao-A及SERT表达。p-MCMV和LPS 1.5μg/kg组均未观察到胎盘各代谢相关酶和SERT的基因表达的改变。而LPS 25μg/kg组虽未观察到各时间点代谢相关酶的改变,但SERT于E14.5d显著高于正常组;5.胎脑血清素代谢通路的改变:孕期急性MCMV感染对胎脑血清素合成限速酶TPH2和转运蛋白SERT的基因表达无明显改变。而p-MCMV组则可以显著降低E14.5d胎脑TPH2和SERT的mRNA水平。此外,LPS 50μg/kg组可以明显升高妊娠晚期（E18.5d）TPH2和SERT的mRNA表达水平。LPS 1.5μg/kg组的胎脑TPH2和SERT表达与正常组无异;6.胎盘血清素的表达和组织分布:正常组胎盘,5-HT在蜕膜、交界区、迷路区、绒毛膜板和卵黄囊各层均有不同程度表达。其中,5-HT在迷路区呈现零星分布。E13.5d时,a-MCMV组和LPS 50μg/kg组胎盘均表现出迷路区显著增多5-HT表达,而其他区域无明显增多。【结论】第一部分小鼠播散性巨细胞病毒感染后肺免疫细胞CD11c表达模式1.MCMV感染后可诱导绝大部分CTLs表达CD11c,这种CD11c的表达可能是CTLs高活化状态和潜在高抗病毒效应的一种表现;2.BALB/c和C57BL/6小鼠的NK细胞和CTLs显示出了不同的CD11c表达模式,这种差异可能与相应免疫细胞独特的抗病毒能力相关;相对于BALB/c小鼠,C57BL/6能够诱导强而持续的NK细胞应答,继而是更为强烈的CTLs反应,有利于MCMV病毒的快速清除;3.B220⁺CD11cⁱntnt NK细胞可能是一种抗MCMV感染更为有效的NK细胞亚群。第二部分小鼠母体巨细胞病毒感染对胎盘和胎脑血清素代谢通路的影响1.孕期急性MCMV感染可致妊娠中期胎盘IL-6 mRNA表达上调,从而从动物模型上证实母体MCMV感染与子代神经精神异常的潜在相关性;2.不同母体免疫激活状态对胎盘和胎脑血清素代谢系统的影响不同:孕期急性MCMV感染可造成胎盘持续性5-HT合成酶转录增加,在引发胎盘5-HT水平增多的同时可能对胎脑的关键发育事件造成影响;孕期50μg/kg LPS刺激可短暂上调胎盘的5-HT合成,并影响妊娠晚期胎脑的5-HT合成酶及转运蛋白的表达;而孕前MCMV感染,虽对胎盘5-HT合成无影响,但可下调妊娠中期胎脑5-HT合成酶及转运蛋白的基因表达。