【摘 要】
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目的:本研究通过增强型绿色荧光蛋白与 p53α真核表达载体构建和表达,观察p53α对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响,为化疗和基因联合治疗肺腺癌提供了实验基础。 方法:通
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目的:本研究通过增强型绿色荧光蛋白与 p53α真核表达载体构建和表达,观察p53α对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响,为化疗和基因联合治疗肺腺癌提供了实验基础。 方法:通过 RT-PCR法扩增人肺腺癌细胞 A549中p53α基因,琼脂糖凝胶回收、纯化后产物与克隆载体 pMD18-T连接、转化;将重组克隆载体与真核表达质粒 pEGFP-N1分别用EcoRI和BamHI酶切,连接、转化、测序等制备质粒载体pEGFP-p53α。脂质体介导将p53α转染H1299细胞,经G418筛选获得稳定表达的p53α阳性细胞克隆并扩增培养。RT-PCR检测转染细胞中p53α基因表达;Western Blot、免疫细胞化学检测转染细胞中TP53蛋白表达;采用 MTT实验和平板克隆实验检测 CDDP、5-FU处理前后稳定细胞株的药物敏感性变化;DAPI染色法检测化疗药CDDP、5-FU作用前后转染细胞凋亡的变化。 结果:转染p53α的H1299细胞稳定表达TP53蛋白。MTT实验提示H1299/pEGFP-p53α细胞存活率显著低于H1299和H1299/ pEGFP-N1细胞(P<0.05),CDDP、5-FU的IC50分别下降了35.7%和45.5%。CDDP、5-FU化疗后,H1299/ pEGFP-p53α细胞克隆形成率与对照组相比,前者的细胞克隆率显著下降,有统计学显著性(P<0.05)。DAPI染色法提示H1299/pEGFP-p53α比H1299和H1299/pEGFP-N1的细胞凋亡率上升(P<0.05)。 结论:1. p53α成功转染H1299细胞并稳定表达。2.体外研究证明:p53α能够增强CDDP、5-FU对H1299细胞的化疗敏感性。
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