一株大洋来源链格孢菌114-1G次级代谢产物及生物活性研究

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海洋微生物在低温低氧、避光高压等独特生态环境中逐渐进化出特殊代谢系统,具备了产生并累积大量具有特殊化学结构和生物活性物质的能力。链格孢菌(Alternaria sp.)分布广泛,是多种活性物质的产生菌。因此,研究海洋来源的链格孢菌次级代谢产物具有较高的潜在应用开发前景。本文选取来自东太平洋洄游性鱼类鲯鳅(Coryphaena hippurus)侧鳍和体表刮取物中筛选分离的一株链格孢菌114-1G为研究菌株。首先,对114-1G菌株进行活化与发酵,将所得到的发酵液和菌丝体的粗浸膏进行活性初步测评,判断该菌株的研究价值。进而优化菌株发酵条件,对发酵产物粗提物进行分离纯化,得到单体化合物并对化合物进行结构鉴定。最后,对获得的单体化合物进行抗肿瘤、抗氧化、抗炎等活性初步筛选和评价。主要研究结果如下:(1)菌株发酵产物粗浸膏活性的测评。114-1G菌株的发酵产物对人宫颈癌Hela、人卵巢癌Skov3以及人肝癌Huh7三种肿瘤细胞系均有抑制活性,其100μg/m L浓度下的抑制率分别为93.15%、79.74%和86.02%,初步确定114-1G菌株具有研究价值。(2)菌株最适发酵条件的筛选。经对菌株发酵条件考察,筛选出114-1G的优选发酵条件为:甘露醇25 g/L,麦芽糖15 g/L,葡萄糖10 g/L,味精10 g/L,大豆蛋白胨5 g/L,酵母提取粉3 g/L,培养基初始p H为7.5,发酵温度为10℃,发酵时间为15 d,培养基中海水添加量为60%,摇床转速为150 r/min。(3)次级代谢产物的分离和结构鉴定。运用正相硅胶层析柱、反相ODS层析柱、葡聚糖凝胶层析、薄层层析、高效液相色谱(HPLC)结合的方法对菌株发酵产物进行分离纯化。利用核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)、异核多碳相关谱(HMBC)、以及同核化学位移相关谱(1H-1H COSY)等波谱分析技术对所得到的单体化合物进行结构分析,最终确定了14个化合物的结构,其中新天然化合物1个(14)。化学结构包括5个环二肽(1,3,4,8,13),1个酯类(2),2个嘧啶类(5,6),1个蒽醌类(7),1个脂肪酸(9),2个双酚A及其酯(10,11),1个吡啶酮类(12),1个羟苯基丁二醇(14)。(4)单体化合物的活性评价。对部分化合物进行抗肿瘤、抗氧化、抗炎等活性筛选。实验结果显示,化合物10和化合物11在浓度为100μg/m L下对Hela细胞的抑制率达到了99.1%和95.0%。在DPPH自由基清除实验中,化合物3、化合物4、化合物9以及化合物14在浓度为0.5 mg/m L时对自由基的清除率分别为50.26%、49.85%、42.54%和46.12%,显示该系列化合物具有一定的抗氧化能力。抗炎活性实验结果显示,化合物14能够抑制细胞中NO的产生,具有一定的抗炎活性。本文研究了链格孢菌114-1G的发酵条件、次级代谢产物的化学结构以及生物活性,丰富了海洋来源微生物发酵条件和次级代谢产物的研究内容,为后续活性物质应用于医药、食品等领域奠定了良好基础。
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