桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取纯化及其降血糖活性的研究

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桑叶为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶,历代中医药书籍中记载桑叶能够治疗消渴症,现代药理研究表明,多羟基生物碱1-脱氧野尻霉素(1-deoxojirimycin, DNJ),是桑叶有效成分之一,它的结构类似天然糖,能竞争性的抑制α-葡萄糖苷酶,具有显著的降血糖作用,因此,桑叶中DNJ的研究得到了国内外学者的广泛关注。本论文以桑叶粉末为原料,研究了桑叶中DNJ的检测、提取、分离纯化、桑叶提取物的降血糖效果以及DNJ纯化物在离体水平上的抑制α-葡萄糖苷酶的活性,主要研究内容和结论如下:1、确定了DNJ的薄层层析(TLC)定性分析方法。采用硅胶G薄层板,以正丁醇:醋酸:水(4.5:1.2:1.2)为展开剂,氯-邻联甲苯胺为显色剂。此法分离效果较好,斑点圆整、清晰,简易灵敏,重现性好,可用于DNJ的快速定性和粗略定量分析。确定了DNJ的高效液相色谱(HPLC)定量分析法,测定了桑树不同部位中DNJ含量。采用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)进行柱前荧光衍生,用高效液相色谱-荧光检测器测定。相关系数R=0.9993,结果表明在0.1-10μg·mL-1之间,线性关系良好。测得桑叶中DNJ的含量为0.223%。此方法具有简便快速,灵敏准确,衍生产物稳定的优点。用高效液相色谱-荧光检测器测定桑枝皮,桑枝木质部,桑白皮,桑葚以及蚕砂中DNJ含量。其中桑枝皮DNJ含量最高,达0.388%,其次是桑葚,桑枝木质部中DNJ含量最低,只有0.051%。2、通过单因素试验和正交试验,对酸水法提取桑叶中DNJ的工艺进行了优化,得到酸水法提取桑叶中DNJ的最佳工艺:提取时间为2.5h,提取温度为70℃,液料比为25:1mL/g, pH为2,在此条件下,DNJ的提取率为0.166%。应用响应曲面设计法优化出桑叶中DNJ的超声波辅助提取的最佳提取条件:时间为60min(超声时间3s,间隙时间5s)、温度为75℃、功率为350W、液料比为16:1mL/g, DNJ的提取得率为0.187%,与模型预测值基本吻合,说明此模型可有效预测和分析超声辅助提取桑叶中的DNJ。通过比较酸水提取法和超声波辅助提取法在最佳提取工艺条件下提取桑叶中DNJ的提取率(分别为0.166%、0.187%),得出超声波辅助提取桑叶中DNJ优于酸水法提取桑叶中DNJ。3、研究了富含DNJ的桑叶提取液对糖尿病小鼠的体内降血糖效果,试验结果显示,糖尿病小鼠“三多一少”的症状随实验进程逐渐得到缓解,并且降血糖效果明显,提取液剂量越高,降血糖效果越好,高剂量降糖效果最佳,呈现剂量效应关系,且效果优于拜糖平。这可能与DNJ的降血糖作用有关。4、研究了001×7型阳离子交换树脂对DNJ的纯化,绘制了DNJ的穿透曲线。结果表明DNJ在流出液的pH大于9时,能穿过树脂流出来,此时,流出液的颜色加深。因此,流出液的pH和颜色可作为判定DNJ穿过树脂的指标。采用阳离子交换树脂纯化DNJ的最佳工艺条件对桑叶中DNJ进行纯化,得到的产品DNJ的纯度达到3.32%,再经阴离子交换树脂纯化之后,DNJ的纯度达到8.24%,然后经超滤,DNJ的纯化达到15.18%。说明DNJ的纯度得到了明显提高。对超滤后纯度为15.18%的样品进性高温处理,得出DNJ热稳定性良好。为开发富含DNJ具有降血糖功效的保健食品的热灭菌打下理论基础。5、研究了在体外条件和离体器官中,DNJ纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,结果表明在体外条件下和离体器官中,DNJ对小肠粘膜上的α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,且DNJ纯度越高,抑制作用越强,当DNJ的纯度在15%左右时,它对α-葡萄糖苷酶的抑制作用优于拜糖平。
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