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目的:慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia)是一种髓系增殖性肿瘤,以9号和22号染色体易位形成BCR/ABL融合基因,编码具有酪氨酸激酶活性的融合蛋白为特征,引起造血干细胞的异常克隆性增殖,而酪氨酸激酶的靶向抑制剂伊马替尼的出现,使95%的CML患者获得了长期无病生存。但是,随着伊马替尼的应用,出现了许多问题,其中最突出的就是伊马替尼耐药,在对伊马替尼耐药的研究中,我们发现约30%的耐药可以用激酶区基因突变来解释,但是很多未发生激酶区突变的患者也出现了耐药,因此,这就需要我们从其他角度来研究其耐药机制。最近的一项对CML患者基因CpG岛甲基化的研究发现,一些基因(如CDKN2B,OSCP1,PGRA,PRGB,TFAP2E等)的高甲基化与CML患者的不良预后及耐药相关。表观遗传学主要从基因组修饰的角度来研究基因表达的调控机制,其引起的表观遗传学改变不涉及基因序列的改变,而DNA甲基化作为表观遗传修饰的重要机制之一,需要甲基化结合蛋白家族来介导,MBD2作为MBD家族的重要一员发挥着巨大作用。因此,研究敲降MBD2基因对慢性髓系白血病细胞系的影响有重要意义。方法:利用CRISPR/Cas9技术设计基因编辑工具,构建敲降MBD2基因的工具质粒,通过电转染技术,将质粒转入K562细胞系(人慢性髓系白血病细胞系)中,待质粒表达后进行酶切,达到敲降基因的目的。接着,通过流式单克隆分选及测序,选出野生型和突变型细胞株。通过RT-PCR和Western-Blot检验敲降效应。然后,通过流式检测细胞凋亡、细胞周期,CCK8法和CFDA SE染色法检测细胞增殖,进一步地,利用集落形和裸鼠成瘤实验来分别检测细胞克隆形成能力及细胞成瘤能力。结果:利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了具有敲降效应的MBD2工具质粒,经电转分选测序获得了敲降MBD2基因的稳定传代的K562细胞株。通过对其生物学行为的研究,我们发现敲降MBD2基因后,K562细胞的凋亡未见明显改变,但是细胞出现了明显的周期阻滞,且大部分阻滞在G0/G1期,细胞的增殖能力也明显受到抑制,克隆形成能力减弱,在裸鼠体内的成瘤能力也明显下降。结论:CRISPR/Cas9技术可以构建出细胞背景统一的基因敲降模型,MBD2基因在慢性髓系白血病细胞中表达下降,降低了其肿瘤干性。其机制可能是由于作为DNA甲基化阅读器的MBD2蛋白缺失,导致DNA甲基化谱表达异常所致。