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实验背景吗啡是阿片受体的激动剂,是临床解除多种急、慢性疼痛的主要药物,有极强的镇痛作用,但在多次反复使用后会出现镇痛效应的明显下降,产生吗啡耐受的现象。在各种疼痛类型中由躯体感觉神经系统的损害或疾病导致的神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NPP)在临床上十分常见,吗啡等阿片类药物是临床上治疗神经病理性疼痛的一种重要药物,但由此引发的药物依赖等不良反应的发生使治疗效果大打折扣。阿片耐受的出现使其无法在临床使用过程中发挥最大作用,为减少这种情况的发生,提高阿片类药物使用后患者的生活质量,全面了解阿片耐受形成的机制并最大程度的恢复其效能具有十分重要的临床意义。因此人们一直在寻找能够使阿片类药物发挥最大镇痛效应并降低不良反应发生率的有效方法。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX),一种高选择性的α2肾上腺素受体(α2-AR)激动剂,具有镇静和抗焦虑作用,且对呼吸、循环影响小等独特优势使其在临床得到广泛应用。有研究发现,右美托咪定可减少机体内炎症因子的释放,且大量文献已经表明,TNF-α、IL-1β等炎症因子可激活并维持炎症性和神经性疼痛,与疼痛的发生和发展密切相关,并可激活或被核因子κB(Nuclear Factor kappa-B,NF-κB)激活。TLR4/NF-κB通路是机体免疫损伤、疼痛传导的一个重要调节信号,那么,在吗啡耐受产生的过程中右美托咪定能否通过调节TLR4/NF-κB信号通路影响吗啡耐受的形成呢?实验目的本实验通过右美托咪定对正常以及神经病理性痛模型大鼠慢性吗啡耐受疼痛行为学的测试,并通过参与吗啡耐受及其引起痛觉过敏可能的信号通路中大鼠脊髓(Spinal Cord,SC)相关分子的检测,以确定右美托咪定对大鼠吗啡耐受形成的影响及可能信号途径,从而确定右美托咪定在吗啡耐受形成过程中的分子机制。实验方法1皮下注射不同剂量右美托咪定对正常大鼠吗啡耐受的影响雄性SD大鼠随机分为5组(n=6):Saline组、Mor+Saline组、12.5μg/kgDEX+Mor组、25μg/kgDEX+Mor组、50μg/kgDEX+Mor组,分别在给药前1天、给药第1、3、5、7天进行tail-flick测试,并计算最大镇痛效率(%MPAE),给药前1天、给药第8天进行机械撤足阈值(Paw Withdrawal Mechanical Threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency,PWTL)测试;并根据上述实验结果选出DEX最佳剂量。2皮下注射右美托咪定对神经病理性痛大鼠吗啡耐受的影响雄性SD大鼠随机分为5组(n=6):Sham组、SNL+Saline组、SNL+Mor组、SNL+Mor+DEX组、SNL+DEX组,其中DEX注射浓度为上述大鼠疼痛行为学测试结果选取的最佳剂量,采用腰5脊神经结扎(Spinal Nerve Ligation,SNL)制备神经病理性痛模型,分别在给药前2天、1天、给药第1、3、5、8、10天进行tail-flick、PWMT、PWTL测试,并计算%MPAE。3鞘内注射吗啡对大鼠脊髓TLR4、磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达的影响雄性SD大鼠随机分为5组(n=3):Control组、鞘内注射吗啡1天、3天、5天、7天组,利用Western-blot技术检测各组大鼠L4-5脊髓中TLR4、磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β在不同时间点的表达水平。4皮下注射右美托咪定对吗啡耐受大鼠脊髓磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达的影响雄性SD大鼠随机分为4组(n=3):Saline组、Mor+Saline组、DEX+Mor组及DEX组,其中DEX注射浓度为上述大鼠疼痛行为学测试结果选取的最佳剂量,给药6天后利用Western-blot技术检测各组大鼠L4-5脊髓中磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的表达水平。5皮下注射右美托咪定对神经病理性痛大鼠吗啡耐受脊髓磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β表达的影响雄性SD大鼠随机分为5组(n=3):Sham组、SNL+Saline组、SNL+Mor组、SNL+Mor+DEX组、SNL+DEX组,给药6天后利用Western-blot技术检测各组大鼠L4-5脊髓中磷酸化NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的表达水平。实验结果1 25μg/kgDEX可有效延缓大鼠吗啡耐受的形成且不良反应小各组大鼠术前1天PWMT、PWTL相比较差异无统计学意义(P>0.05);与Mor+Saline组相比,12.5μg/kgDEX+Mor组%MPAE、PWMT、PWTL升高不明显(P>0.05),25μg/kgDEX+Mor组和50μg/kgDEX+Mor组%MPAE、PWMT、PWTL明显升高(P<0.05);50μg/kgDEX+Mor组右美托咪定镇静效果与12.5μg/kgDEX+Mor和25μg/kgDEX+Mor组相比显著较强,综合分析,我们选择25μg/kg作为右美托咪定的最佳剂量。2 DEX可延缓神经损伤后大鼠吗啡耐受的产生各组大鼠术前1天PWMT、PWTL相比较差异无统计学意义(P>0.05),且Sham组大鼠各时间点PWMT、PWTL与术前基础值相比无明显变化(P>0.05),而SNL+Saline组明显降低(P<0.05);与SNL+Saline组相比,SNL+Mor组大鼠%MPAE、PWMT、PWTL均降低(P<0.05),%MPAE随注射时间至第5天降到基础值附近(P<0.05);右美托咪定处理后(SNL+Mor+DEX组)与SNL+Mor组相比%MPAE、PWMT、PWTL明显升高(P<0.05);单独使用右美托咪定组与SNL组相比%MPAE、PWMT、PWTL也有所升高(P<0.05)。3 TLR4/NF-κB信号通路参与吗啡耐受的产生与Control组相比,鞘内使用吗啡后,大鼠脊髓中TLR4、p-p65表达水平升高(P<0.05),炎症因子TNF-α、IL-1β表达水平较前者也明显升高(P<0.05)。4 DEX可通过TLR4/NF-κB信号通路延缓吗啡耐受的产生与Saline组相比,Mor组大鼠脊髓中p-p65、TNF-α和IL-1β表达水平明显升高(P<0.05),Mor+DEX组p-p65、TNF-α和IL-1β较Mor组又有所下降(P<0.05)。5 DEX可通过TLR4/NF-κB信号通路延缓神经病理性痛大鼠吗啡耐受的产生与Sham组相比,SNL+Saline组大鼠p-p65、TNF-α和IL-1β表达水平升高;鞘内注射吗啡(SNL+Mor组)后,脊髓中p-p65、TNF-α和IL-1β表达水平升高更为明显(P<0.05),使用右美托咪定(SNL+Mor+DEX组)可降低其在大鼠脊髓中的表达(P<0.05)。实验结论右美托咪定可以延缓大鼠吗啡耐受的形成,增强吗啡的镇痛效果,其机制可能与抑制脊髓TLR4/NF-κB信号通路的激活,减少TNF-α和IL-1β等相关炎症因子的产生有关。