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研究目的:结肠癌(colon cancer)是消化系统常见的恶性肿瘤,发病率正逐年攀升。早中期结肠癌患者首选手术治疗,并根据术后病理分期决定化疗方案,但晚期结肠癌患者的生存期及预后仍不甚理想,目前以化疗、分子靶向治疗、放射治疗、介入治疗及中药治疗等综合治疗为主。在我国,中医药改善肿瘤患者生活质量,提高肿瘤患者生存期的作用不断得到重视和发展。很多晚期结肠癌患者往往在中西医结合的综合治疗中得到了获益。中医药治疗通过减轻结肠癌患者的放、化疗毒副反应,预防结肠癌患者术后复发及转移的倾向,提高结肠癌患者的生活质量及生存期方面具有一定优势,但中医药治疗往往通过中药复方治疗发挥作用,存在较大个体差异,具体的抗癌作用机制及分子靶点仍不明确,因此,对中药抗肿瘤作用机制的研究有利于进一步为临床治疗提供参考。在前期研究中发现,中药提取物贝母素乙(peiminine)在体外实验中能够抑制人结肠癌HCT-116细胞生长。本研究拟通过凋亡、自噬、代谢组学研究技术进一步探讨peiminine对人结肠癌HCT-116细胞关键代谢通路的影响,以期明确peiminine对人结肠癌HCT-116细胞的分子作用靶点和作用机制,为该药物的进一步开发及临床应用提供有效的理论依据。研究方法:1.采用CCK-8法观察经不同浓度(50μM、100μM、200μM、400μM)中药提取物贝母素乙处理人结肠癌HCT-116细胞的增殖活性,对照组采用相同体积的DMSO,并通过Annexin V PI双染流式细胞学检测细胞凋亡及凋亡率。2.将稳定表达GFP-LC3的质粒成功转染至HeLa细胞,在共聚焦显微镜下观察自噬体;不同浓度(50μM、100μM、200μM、400μM)中药提取物贝母素乙作用人结肠癌HCT-116细胞、HeLa细胞、MEF细胞,对照组用相同体积的DMSO处理,通过蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3B-Ⅱ的相对定量。3.通过GC-MS及UPLC-MS/MS分别对经贝母素乙处理的HCT-116细胞和空白对照组的胞内代谢物进行指纹图谱分析,进一步应用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对代谢组学数据进行多维统计分析。研究结果:1.浓度梯度为(50μM、100μM、200μM、400μM)的贝母素乙可使HCT-116细胞增殖活性降低,且随着作用浓度的增加,活性越来越低,显示出剂量-效应关系;经过Annexin V PI双染流式细胞仪检测浓度分别为100μM、200μM和400μM的贝母素乙诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡发现,随着贝母素乙浓度增加细胞死亡数明显越来越多,尤其在200μM、400μM明显,并且呈现剂量依赖性。2.贝母素乙作用于HeLa-GFP-LC3细胞,在共聚焦显微镜下,明显看到贝母素乙组中多个明亮绿色荧光斑点聚集成团块状,自噬斑形成,且随着贝母素乙浓度的升高,自噬斑的数量进一步增多,与剂量成正相关,在浓度200μM观察最为清晰,而对照组用相同体积的DMSO处理,呈散点状分布,未形成自噬斑;蛋白免疫印迹检测经不同浓度(50μM、100μM、200μM、400μM)贝母素乙作用的人结肠癌HCT-116细胞、HeLa细胞、MEF细胞,对照组用相同体积的DMSO处理,较对照组相比,HCT-116细胞内LC3B-II/LC3B-I比值随浓度呈剂量依赖性显著升高,且在200μM和400μM增高趋势明显,在HeLa细胞、MEF细胞也有相同趋势。3.比较经贝母素乙处理的人结肠癌HCT-116细胞与未经处理的空白对照组人结肠癌HCT-116细胞,经GC/MS与UPLC/MS-MS得到代谢图谱并通过PLS-DA相关软件对数据进行综合分析检测出了57个代谢物不同,其中45个升高,12个降低。在这升高的45个代谢物中,特别是葡萄糖、谷氨酰胺及甘油三物质是氨基酸代谢、碳水化合物代谢及脂类代谢三大代谢中的关键分子。剩下降低的12个代谢物中包括4个氨基酸、1个与维生素相关、4个脂类及3个肽类。结论:1.贝母素乙能抑制HCT-116细胞增殖和诱导其凋亡。2.贝母素乙能增强HCT-116细胞自噬蛋白LC3B-I及LC3B-II表达水平。3.贝母素乙对HCT-116细胞的57个代谢物,包括葡萄糖、谷氨酰胺及脂类代谢物,并且对P13K/Akt/mTOR及氧化应激代谢通路的激活具有一定影响。