程序性细胞死亡是指在某些生理或病理条件下自主有序的细胞死亡,是一个主动过程,涉及一系列基因的激活、表达以及调控,主要包括凋亡,程序性坏死和自吞噬介导的细胞死亡。程序性细胞死亡在机体正常发育过程中具有重要作用,同时也是许多常见复杂疾病(如肿瘤、自身免疫病、炎症、病毒感染、神经退行性疾病如中风、阿尔兹海默病和帕金森病等)的重要致病因素之一。秀丽隐杆线虫在细胞凋亡研究中具有特殊的重要地位。线虫的ced(CE11 Death abnormality)基因(ced-1～ced-13)是凋亡执行的核心基因,在果蝇、人类等物种中序列高度保守且具有相同或类似的功能。线虫的ced-8基因缺陷会导致发育过程中的细胞凋亡被大幅推迟并减少。BLAST结果显示,ced-8基因及CED-8蛋白在多种远源物种(海绵、线虫、海葵、果蝇、斑马鱼、小鼠和人)中高度保守。人类基因组中有多个ced-8的同源基因,它们组成了 XK相关蛋白基因家族(kk related,xkr),合计有xkr1-xkr9及xkr-Y、xkr-Y2共十一个成员。miRNA是真核生物中一类内源性非编码的长度约为18～25个核苷酸的单链小分子RNA,能在转录后水平调节基因的表达。miRNA广泛参与个体发育、器官形成、病毒防御、细胞分化、增殖与凋亡等生命进程。目前尚未有文献报道调控xkr的miRNA。本研究的目的就是探究细胞发生凋亡时xkr家族各基因表达量的变化,使用miRNA-靶基因互作在线预测工具,预测靶向调节人和斑马鱼xkr家族成员的高评分候选miRNA,并进行实验验证,鉴定调控xkr家族基因的miRNA并分析miRNA-xkr互作的保守性。采用顺铂(cisplatin)诱导人胚肾细胞HEK293T凋亡模型,细胞发生凋亡后采用实时荧光定量RT-PCR检测xkr家族各基因转录量的变化,并采用免疫印迹(Western Blot)检测XKR家族各蛋白表达量的变化。为了鉴定调控xkr家族基因的miRNA,采用网站预测与实验验证相结合的方法,首先利用TargetScan等miRNA-靶基因互作在线预测工具,获得调控xkr家族基因的候选miRNA。其次,构建候选miRNA的过表达载体、人及斑马鱼xkr靶基因的3’UTR的野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体,共转染293T细胞后通过检测报告基因活性变化评价候选miRNA对xkr靶基因的敲降作用。最后,对双荧光素酶报告基因检测为阳性的候选miRNA,转染miRNA过表达载体或miRNA抑制剂,采用qRT-PCR在mRNA水平检测候选miRNA对内源性xkr基因表达的影响。实验结果表明,在细胞发生凋亡时,xkr1基因在mRNA水平和蛋白水平都显著上调,时间效应曲线表明顺铂诱导细胞凋亡18h时,xkr1的表达量达到最高丰度。本实验综合多个网站预测打分较高且保守性较好的miRNA-xkr互作,涉及人类xkr基因家族的5个成员和斑马鱼xkr基因家族的2个成员以及相关的8个miRNA。包括 miR-143、miR-98 与 xkr1;miR-29b 与 xkr4;miR-21、miR-200b、miR-29b、iniR-129-5p以及miR-31与xkr6,其中xkr6基因上存在miR-29b的上下游两个结合位点;miR-98;miR-200b、miR-21与xkr8;miR-29b与斑马鱼xkr6和xkr7。双荧光素酶报告基因检测细胞外源水平的实验结果表明大部分预测结果是阳性的,也存在少数阴性,如miR-129-5p对xkr6没有敲降作用,而miR-31对xkr6的结合作用较弱;miR-98和miR-21与xkr8之间也没有相互作用。对于双荧光素酶报告基因检测呈阳性且抑制量达70%以上的互作,我们利用RT-PCR以及荧光定量RT-PCR在细胞内源转录水平最终筛选鉴定了调控人及斑马鱼xkr家族基因的多个miRNA。其中miR-143和miR-98 靶向抑制 xkr1;miR-29b 靶向调控 xkr4;miR-21、miR-200b 和 miR-29b 靶向调节xkr6,并且斑马鱼的xkr6和xkr7同样也受dre-miR-29b调控;xkr8也受miR-200b靶向调控。我们的结果表明miR-200b和miR-29b可以调控xkr家族的多个基因,miR-29b在人类及斑马鱼中对xkr家族各基因的调控具有一定的保守性。