间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类存在于骨髓、脂肪、肌肉、肺、肝等多种组织中的干细胞群,能够分化为脂肪、骨和肌肉等多种细胞类型。作为骨细胞和脂肪细胞的共同来源,MSCs在成骨、成脂分化之间保持着微妙的平衡。转录因子在MSCs成骨分化、成脂分化的命运决定中发挥着十分重要的作用,大量体外研究表明诱导成骨的因子常抑制成脂,而诱导成脂的因子常抑制成骨。HOXA10是HOX转录因子家族的成员之一,参与胚胎发育、细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤发生等多种生物过程的遗传控制。绵羊作为一种重要的家畜品种,是人类肉食的重要来源之一。绵羊骨骼尤其是脊椎的正常发育对其胴体重量具有重要影响,而肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)的含量则是决定羊肉质量的重要因素之一。HOXA10对这两种组织的发育具有重要的调控作用,但迄今为止,有关HOXA10在绵羊中的功能研究很少见到。因此,本研究旨在探讨HOXA10在绵羊MSCs的细胞增殖、凋亡、成脂、成骨分化中的作用,并阐释其调控成脂、成骨分化的相关机制。本研究由两个部分构成。在第一部分中,我们从3月龄绵羊胎儿骨髓和骨骼肌中分离MSCs,分别称为绵羊骨髓间充质干细胞(sheep bone marrow MSCs,sBMSCs)和绵羊肌肉间充质干细胞(sheep muscle-derived MSCs,sMDSCs);然后,以HOXA10内源性表达水平较低的sMDSCs为研究对象,研究HOXA10过表达对细胞增殖、凋亡和成骨、成脂分化的影响。从3月龄绵羊胎儿的骨髓和骨骼肌中,我们成功分离到了sBMSCs和sMDSCs。在体外培养时,这两种细胞的形态与成纤维细胞高度相似,表达MSCs阳性标记分子CD44、CD90和CD105,不表达阴性标记分子CD34、CD45和Desmin。与绵羊胎儿成纤维细胞(sFFs)相比,多能性和自我更新相关因子OCT4、NANOG、AKP和TERT在sBMSCs和sMDSCs中显著高表达,而SOX2表达几乎没有差异。在适当的诱导条件下,sBMSCs和sMDSCs都能够分化为骨细胞和脂肪细胞。以上结果表明,我们分离所得sBMSCs和sMDSCs具有自我更新能力和成脂、成骨分化能力,可用于后续对成脂、成骨分化机理的研究。通过qRT-PCR技术,我们检测了sBMSCs和sMDSCs中内源HOXA10的表达水平,选择了内源HOXA10表达水平较低的sMDSCs作为后续研究材料。通过使用HOXA10过表达载体转染sMDSCs,研究HOXA10过表达对细胞增殖、凋亡、成骨和成脂分化的影响。研究结果显示,HOXA10过表达能促进sMDSCs增殖,并显著提高S期和G2/M期的细胞百分比。而且,在sMDSCs中过表达HOXA10后,PCNA、Cyclin A、Cyclin D2、CDK4的表达量显著上调,p57表达量显著下调,暗示HOXA10可能通过减弱p57对Cyclin D-CDK4的抑制作用而加快细胞周期进程,从而促进细胞增殖。此外,HOXA10过表达抑制sMDSCs的凋亡,上调凋亡抑制因子BCL2的表达而下调Cleaved CASPASE3和促凋亡因子BAX的表达。双荧光素酶活性实验证明HOXA10可直接上调BCL2的启动子活性,可能和HOXA10抑制sMDSCs凋亡相关。此外,HOXA10过表达还可激活PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路,可能也和HOXA10促增殖、抑凋亡的作用有关。前人的研究证明,HOXA10通过直接激活成骨分化相关基因RUNX2、OCN和ALPL的转录而调控成骨分化。我们的研究发现HOXA10过表达能显著上调成骨分化相关因子RUNX2、OPN和ALPL mRNA和蛋白表达水平,最终促进sMDSCs的成骨分化。在成脂分化方面,我们发现HOXA10过表达可促进FABP4而抑制LPL mRNA和蛋白的表达,最终抑制sMDSCs中的脂质积累。使用JASPAR数据库,我们预测FABP4的启动子区域存在6个潜在HOXA10结合位点,LPL的启动子区域存在3个潜在HOXA10结合位点。随后的双荧光素酶活性实验证明HOXA10可直接上调FABP4的启动子活性而下调LPL的启动子活性。在此基础上,我们推测,至少在一定程度上,HOXA10可通过调节FABP4和LPL的转录水平来调控sMDSCs的成脂分化。在第二部分研究中,为了进一步阐明HOXA10在sMDSCs中的功能及其分子机制,我们使用CRISPR/Cas9技术和基于pcDNA3.1(+)的HOXA10过表达载体分别构建HOXA10敲除和过表达单克隆细胞系,然后通过转录组测序和比较分析对HOXA10的作用机制进行研究。使用在线工具E-CRISPR和Cas-OFFinder进行sgRNA的设计和分析后,我们通过T7E1酶切实验检测了各sgRNA的打靶和脱靶效率。综合评估打靶和脱靶效率两个因素后,我们选择了一对靶向绵羊HOXA10外显子1的sgRNAs进行HOXA10敲除。通过PCR扩增和测序对所得单克隆细胞系的基因型进行鉴定,结果显示不同单克隆细胞系的HOXA10基因在相同位置处发生突变,表明双sgRNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑比单个sgRNA更加高效。特别地,纯合型单克隆细胞系HOXA10-KO-1在HOXA10外显子1上发生74 bp的双等位基因缺失(核苷酸位置34到107),可能导致该基因开放阅读框位移和早期翻译终止,从而造成同源域(homeodomain)丢失。另一方面,通过G418选择培养、qRT-PCR和Western Blot验证,我们获得了稳定的HOXA10过表达细胞系及其对照细胞系。接下来,我们对HOXA10敲除和过表达单克隆细胞系进行了RNA测序和全转录组分析。首先,我们从HOXA10纯合子敲除细胞系HOXA10-KO-1(HOXA10-KO)、野生型细胞系(WT)、HOXA10过表达细胞系HOXA10-OV-4(HOXA10-OV)和对照细胞Contr-4(Contr)中各提取3个总RNA的生物重复样品,4种样品被分为两组进行了基因表达谱分析:(I)HOXA10-KO vs WT(II)HOXA10-OV vs Contr。以|log2 Fold change|≥1.0和q<0.05为标准筛选显著差异基因(differentially expressed genes,DEGs)。通过比较组(I)和组(II)的DEGs,我们获得了172个潜在的HOXA10靶标基因,包括42个正调控基因和130个负调控基因。随机选出22个基因进行qRT-PCR验证,结果显示测序结果是可信的。GO-term富集分析显示,潜在HOXA10靶基因主要与细胞过程、生物调节、代谢过程和发育过程等生物过程相关,指出HOXA10在转录调节、分子功能和信号传导中可能具有重要作用。此外,27条显著富集的KEGG信号通路(P≤0.05)则为研究HOXA10调节分化、发育和其他生物学过程的机制提供了有价值的信息。NLRP3是HOXA10的潜在靶基因之一。基于JASPAR数据库的预测结果显示NLRP3的启动子区域存在3个潜在HOXA10结合位点;随后的双荧光素酶活性实验证明HOXA10可直接下调NLRP3启动子的活性。NLRP3是一种可以被多种因素激活的细胞内传感器,激活的NLRP3可与ASC(apoptotic speck protein)和procaspase-1形成炎症小体。在本研究中,我们证明通过LPS和PA处理激活NLRP3炎症小体会减弱HOXA10对sMDSCs的促成骨、抑成脂作用,即NLRP3炎症小体参与了HOXA10对sMDSCs成脂、成骨分化的调控,为进一步阐释HOXA10调控成脂和成骨分化的机制提供了实验依据。