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本课题采用短发夹RNA (Short-hairpin-RNA, shRNA)和小干扰RNA (Small interference RNA, siRNA)两种方法筛选乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的干扰RNA,选择干扰效果好的RNA干扰序列重组到慢病毒载体上,构建慢病毒干扰RNA稳定表达模型。该模型能有效抑制BCRP/ABCG2的mRNA表达和蛋白表达水平,并能强强烈抑制BCRP活性,逆转其耐药性。RNA干扰慢病毒稳定转染细胞株也可以方便地用于BCRP底物和抑制剂的筛选和确证,为新药研发和药物合理应用研究提供高效模型,拓展RNA干扰的应用范围。1、shRNA表达质粒的构建及其对BCRP的干扰作用应用基于米托蒽醌高剂量诱导时间递增的“两阶筛选法”建立MCF7/MX100耐药细胞,并经western blot. MTT实验鉴定。结果表明MCF7/MX100细胞与亲本细胞相比,BCRP蛋白表达明显增加。MCF7/MX100比亲本细胞MCF7耐药性显著上升,ICso从1.014±0.11μmol/L上升到4.064±0.38μmol/L(P<0.001).构建shRNA表达质粒,包括siRNA的设计,双链干扰片段模板制备以及质粒扩增。表达质粒为pSilencer4.1,构建成功后进行质粒测序及电泳鉴定,然后转染至MCF7/MX100耐药细胞中,采用RT-PCR、western blot、流式细胞术实验考察干扰效果。阳性对照shRNA效果明显,但是本论文设计的位点对BCRP mRNA的表达没有明显抑制效果。2、化学合成siRNA及其对BCRP的干扰作用考察了针对BCRP mRNA不同位点获得的三条化学合成siRNA (si-BCRP1, si-BCRP2, si-BCRP3)对MCF7/MX100细胞中BCRP蛋白的干扰作用。RT-PCR和Western blot检测结果显示：si-BCRP2和si-BCRP3组干扰效果明显,mRNA抑制率分别为97%和95%,蛋白的表达抑制率分别为76%和71%。流式细胞术实验结果显示：si-BCRP2和si-BCRP3组对米托葸醌的敏感性明显提高,与对照组差异有显著性(P<0.01)。3、干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株的建立从前面两部分研究筛选出干扰效果好的干扰序列,扩增siRNA模板,酶切连接到pTRIPZ质粒中,然后采用转染试剂Roche X-tremeGENE在状态良好的lenti293t细胞中进行慢病毒包装。包装48h后收集病毒液,MCF7/MX100耐药细胞用8μg/mL polybrene感染病毒。然后经过嘌呤霉素(1μg/mL)筛选和强力霉素(1μg/mL)诱导,构建干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株：Lenti-BCRP2和Lenti-BCRP3。RT-PCR, Western blot和流式细胞术法检测各组慢病毒干扰稳定转染细胞株中BCRP的基因表达以及活性情况。结果显示,Lenti-BCRP2和Lenti-BCRP3组的mRNA抑制率分别为72%和56%,蛋白表达的抑制率分别为70%和53%, Lenti-BCRP2的药物敏感性也显著增加(P<0.05)。4、干扰BCRP/ABCG2基因的慢病毒稳定转染细胞株的应用本章考察了二氢杨梅素(30μmol/L),异鼠李素(25μmol/L),淫羊藿苷(10pmol/L)在慢病毒稳定转染细胞株中的单独积聚以及与米托葸醌(5μmol/L)的相互作用。单独积聚总孵育时间为45min,而相互作用考察时先加中药有效成分预孵育15mmin,然后加米托葸醌孵育30mmin。采用UPLC-MS/MS液质联用分析方法,记录色谱图,以标准曲线法求出细胞内米托蒽醌以及中药有效成分的浓度,单位时间内细胞中的药物积聚量用细胞裂解液蛋白含量进行校正。结果显示在BCRP干扰组中,诱导后异鼠李素的积聚显著增加,预测异鼠李素是BCRP的底物。与米托葸醌共同孵育结果显示各组细胞经二氢杨梅素和淫羊藿苷处理前后经典底物米托葸醌的积聚均没有显著差异,表明二氢杨梅素和淫羊藿苷不是BCRP的抑制剂；而异鼠李素处理前后,Lenti-NC-, Lenti-NC+, Lenti-BCRP-组经典底物米托葸醌的积聚均有显著性差异,表明异鼠李素为BCRP的抑制剂。综上,异鼠李素可能既是BCRP的底物又是其抑制剂。