实验目的：　　 疟疾给人类带来的严重健康危害和社会经济负担已经推动了全球疟疾行动计划的发展,世界卫生组织再次把对疟疾的消灭工作纳入到议事日程中。实现这个宏伟目标所面临的最大挑战就是干预疟疾在全球的传播,而阻断疟疾传播的疫苗无疑是最为理想的手段。传播阻断疫苗(TBV)的原理是以有性阶段虫体特异表达的表面靶蛋白作为抗原免疫人体,使之产生抗有性阶段虫体表面蛋白的特异性抗体,从而导致有性阶段疟原虫的进一步发育障碍,阻断疟原虫的传播。从群体角度出发,个体接种TBV后,受益的将是整个流行区内的人群。恶性疟原虫和间日疟原虫在全球流行最为广泛,世界上大约40%的人口生活在间日疟流行区,每年导致1.3亿人的感染。恶性疟和间日疟流行区的临床资料表明:问同疟的传播更难以控制,其重要的原因就是间日疟配子体在患者出现临床症状前已经出现在外周血液中,提示患者在治疗前就已经能够传播疟疾,因此对于控制间日疟来说,有效的TBV的研制开发尤为重要。　　 配子体是患者外周血液中所存在的疟原虫有性阶段的开始,能够随着血液被蚊子吸食到其体内,然后雌雄配子体在蚊胃内继续发育,成为雌雄配子;后者经受精形成合子,合子变长,能动成为动合子。动合子穿过胃壁上皮细胞或其间隙,在蚊胃基底膜下形成圆球形的卵囊。卵囊进行孢子增殖,形成数以万计的子孢子。子孢子随卵囊破裂释出或由囊壁钻出,经血淋巴集中于按蚊的唾液腺,当受染蚊再吸血时,子孢子即可随唾液进入人体,造成疟疾的传播。大量的研究已经表明,不论是自然感染,还是注射疫苗,所诱导产生的抗体随着蚊子吸血进入到蚊体内,均能抑制疟原虫在蚊胃内的发育,从而阻止原虫完成生活史。目前最令人关注的传播阻断候选抗原包括表达在配子体表面的受精前抗原P48/45和P230,及表达在合子、动合子表面的受精后抗原P25和P28。到目前为止,只有Pfs25和Pvs25已经进入人体临床试验阶段。而关于间日疟原虫相关抗原的研究相对滞后,目前只有Pvs25和Pvs28研究的相关报道。P48/45蛋白是表达于疟原虫有性阶段配子体和配子表面的主要蛋白,其在雄配子的受精过程中发挥着关键性作用,P48/45基因突变的雄配子在粘附和钻入雌配子时受到强烈抑制,动合子的形成数量明显减少。特异性单克隆抗体结合。P48/45构象表位后,同样能够抑制雄配子的受精而发挥传播阻断作用。P25是疟原虫蚊发育阶段合子和动合子表面表达的主要蛋白,对识别蚊胃表面受体,穿过蚊胃上皮细胞及囊合子的形成具有重要的作用。并且,前期我们对我国间日疟原虫单一和混合流行区分离株PvsP48/45全长基因及Pvs25基因进行了克隆和序列分析,实验结果显示,我国间日疟原虫中低密度单一流行区和高发的混合流行区分离株Pvs48和Pvs25基因均具有高度的保守性。以上结果表明,P48/45和P25作为传播阻断候选抗原均具有明显的优势和可行性。　　 目前Debabani等已在大肠杆菌中表达出具有良好免疫原性的全长重组Pfs48/45,通过膜饲实验显示其抗体具有明显的传播阻断活性。但关于间日疟原虫Pvs48蛋白的表达,还未见报道。本研究通过对间日疟原虫P48抗原,进行基因密码子优化,体外合成基因,构建原核表达载体,尝试体外原核表达重组蛋白Pvs48(rPvs48),并对表达的蛋白进行了免疫活性检测,旨在为有效抗间日疟原虫传播阻断疫苗的研制开发提供理论和实验依据。　　 目前尚不能对间日疟原虫进行体外培养,这一事实在很大程度上制约了人们对间日疟原虫进行更为深入地研究,而鼠疟恰好为人类疟原虫的研究提供了良好的动物模型。重组蛋白的免疫原性依赖于抗原表位结构的正确折叠,佐剂的使用及多重免疫,然而核酸疫苗能够满足这些需求。核酸疫苗可以在宿主体内表达具有构象结构的抗原,既能诱导体液免疫应答,又能诱导细胞免疫应答。我们前期已经构建了约氏疟原虫Pys48核酸疫苗(DV/Pys4.8),并对其免疫活性进行了初步探讨。在此,本研究进一步利用成功构建的DV/Pys48免疫BALB/c小鼠,对机体免疫功能特点进行了研究,探讨P48蛋白作用于机体的免疫应答机制,并且通过再感染约氏疟原虫,进一步探讨其传播阻断效应,以期为有效疟疾疫苗的研制开发提供新的理论依据。　　 实验方法：　　 1、PVs48基因合成及原核表达载体构建　　 根据SalⅠ基因(GeneBank#XM_001614196)和E.coli表达系统,对目标基因的密码子序列进行优化设计和合成,两端插入XbaⅠ和XhoⅠ的酶切位点,扩增并抽提含有目标基因Pvs48的载体质粒,将目标基因亚克隆到Ecoli表达载体pET30a上,测序验证构建重组表达质粒的准确性。　　 2、rPvs48的表达及纯化　　 扩增并抽提构建好的表达质粒,将表达质粒转化到高效的E.coli表达菌株BL-21中。至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中,扩增并诱导表达目标蛋白。SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的制备。37℃摇瓶培养1L重组细菌,待OD600大约1.0时,加入1mMIPTG诱导表达目标蛋白。对表达产物先增溶后,再通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。对洗脱样品及透析后的产品用抗His单克隆抗体进行Westernblot检测,最终蛋白产品通过0.22μm滤膜过滤除菌,采用Bradford法检测蛋白产品浓度。　　 3、实验动物免疫及血清采集　　 (1)rPvs48免疫:将6～8w雌性BALB/c小鼠随机分成2组,每组5只。第一组为rPvs48免疫组,第二组为单纯佐剂对照组。第一组将300μl含有50μgrPvs48的缓冲液与300μl完全弗氏佐剂充分乳化后,进行腹腔内注射免疫。分别于初次免疫后3w和6w,以等量重组蛋白加不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫。第二组对照组初次只用300μl完全弗氏佐剂免疫,分别于初次免疫后3w和6w,再用300μl不完全弗氏佐剂加强免疫。于免疫前3天及免疫后2w、5w、8w进行小鼠尾尖采血(100μl/次),收集免疫血清待测。　　 (2)DV/Pys48免疫:无内毒素质粒提取试剂盒提取DV/Pys48质粒。将含有50μgDV/Pys48的PBS缓冲液100μl接种于6～8w雌性BALB/c小鼠的皮下肌肉内,对照组注射100μl含有50μg空质粒,分别于初次免疫后3w和6w,以等量质粒进行2次加强免疫。并于每次免疫前1～3d尾尖采集小鼠血液,分离血清,-20℃冻存。最后一次免疫3w后,将鼠随机分成两组,一组经腹腔感染1×106Py17XL,寄生的红细胞;另一组小鼠处死后用于免疫指标的检测。　　 4、Py17XL配子体分离　　 Py17XL感染BALB/c小鼠,待感染率达40～50%(配子体率5%左右),乙醚麻醉,心脏采血,经CF11纤维素柱去除白细胞,45%的Percoll密度梯度离心分离,室温350g离心20min,收集中间灰白层配子体,PBS清洗2次,取10μl涂布在玻片,Giemsa染色,光镜下计数配子体含量,剩余配子体经0.01%皂甙-PBS裂解红细胞膜,-80℃冻存。　　 5、ELISA检测血清特异性抗体　　 (1)rPvs48免疫:用溶解在碳酸盐缓冲液的rPvS48(6μg/ml)包被96孔酶标板。　　 (2)DV/Pys48免疫:用溶解在碳酸盐缓冲液的配子体抗原(5μg/ml)包被96孔酶标板。　　 4℃过夜,用含1%BSA的PBS封闭1h,以PBS缓冲液连续倍比稀释免疫后不同时间的小鼠血清,每孔100μl,37℃孵育2h,PBST清洗,加入1:5000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG,孵育1h,PBST清洗,加入底物邻苯二胺和过氧化氢进行显色,酶标仪检测492nm处OD值。结果判定:以吸光度大于阴性对照均值+3S.D作为阳性反应的标准。抗体效价为实验组和阴性对照组光吸收比值≥2.1时的最大稀释倍数。　　 6、间接免疫荧光试验　　 将间日疟原虫感染的外周血涂布荧光片,冷丙酮固定10min。用含5%脱脂奶粉的PBS37℃封闭30min,加入1:10稀释抗血清,37℃孵育60min,在FITC标记的羊抗鼠IgG血清中反应60mm,DAPI染色5min,封片,荧光显微镜观察。　　 7、核酸疫苗免疫小鼠脾细胞培养上清中细胞因子的检测　　 常规无菌取三次疫苗免疫后小鼠的脾脏,制备浓度为1×107/ml脾细胞悬液,于24孔培养板中培养48h后,收集培养上清,用双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测IFN-γ和IL-4产生水平。酶标仪测定450nm处的0D值,结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线,应用SoftMaxPro4.3.1LS软件分析,计算细胞因子含量。　　 8、核酸疫苗免疫小鼠脾细胞样品荧光抗体染色　　 常规方法制备脾细胞悬液,用0.17mol/LNH4Cl裂解红细胞。用含10%胎牛血清的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。　　 (1)树突细胞亚群检测:每份样品用抗CD11c-FTTC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行三色分析,另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml,再加入抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色,离心去上清后,用0.5mlPBS重悬浮细胞,流式细胞仪进行检测。　　 (2)树突细胞胞内TLR9表达水平:每份样品用CD11c-FITC单抗进行染色,用固定液固定,专用透膜液透膜后,加入生物素标记的TLR9单抗孵育后,再加入PE标记的亲和素,另设阴性对照管。避光孵育15min,离心去上清后,用0.5mlPBS重悬细胞,流式细胞仪进行检测。　　 (3)脾细胞中分泌IgG抗体的B细胞数量:每份样品用CD45R/B220-PerCP单抗和抗IgG-FITC抗体进行双色染色,另设阴性对照管和各单标管。避光孵育15min,离心去上清后,用0.5mIPBS重悬细胞,流式细胞仪进行检测。　　 9、体外培养合子和动合子,并计数　　 尾静脉采集Py17XL(1×106PRBC)感染DV/Pys48免疫后小鼠的第3天血液10μl于0.5ml离心管中,加入动合子培养液90μl。24℃培养24h,收集培养悬液,取1μl悬液滴于荧光载片,冷丙酮固定10min。用含5%脱脂奶粉的PBS37℃封闭30min,加入抗Pys25McAbs(1:200稀释),37℃孵育2h。加入FITC标记的羊抗鼠IgG(1:100稀释)20μl,37℃孵育60min,封片,荧光显微镜下计数合子和动合子的形成数量。　　 实验结果：　　 1、rPvs48的表达结果及检测　　 成功构建rPvs48的大肠杆菌表达系统,经经37℃,1mMIPTG诱导3h后,行SDS-PAGE,可见大量目标蛋白Pvs48(～48kD)的表达,同时发现目标蛋白以包涵体的形式基本存在于破菌沉淀中。进一步对包涵体增溶,再将目标蛋白经过His-tag亲和柱纯化,并对洗脱及透析后的样品进行Westernblot检测,均可清晰看到目标蛋白条带,检测其蛋白纯度＞80%。　　 2、免疫血清特异性抗体水平变化　　 (1)rPvs48免疫血清:于初次免疫后2周,重组蛋白免疫组小鼠血清特异性抗体水平开始出现有意义的升高。两次加强免疫后抗体一直维持在较高水平,与单纯佐剂组相比差异显著(P＜0.01)。重组蛋白初次免疫后,抗体效价大约为1:20000,加强免疫后效价已超过1:320000,而再次加强免疫后抗体效价已超过1:640000。　　 (2)DV/Pys48免疫血清:初次免疫后3w,疫苗免疫组小鼠血清抗体水平即开始升高。两次加强免疫后抗体一直维持较高水平,与空质粒组相比差异显著(P＜0.01)。DV/Pys48初次免疫后,抗体效价约为1:1600,初次加强免疫效价为1:3200,再次加强免疫后抗体效价达1:6400。　　 3、免疫血清特异性抗体对天然配子体抗原的识别　　 通过间接免疫荧光实验,经重组蛋白免疫组抗血清处理后的玻片,在荧光显微镜下可见带有绿色荧光的圆球形的配子体,而单纯佐剂组未见配子体。证实用重组蛋白免疫小鼠,获得的血清中抗体能特异性结合天然配子体表面抗原。　　 4、核酸疫苗免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平　　 DV/Pys48免疫组脾细胞上清中IL-4水平明显升高,与空质粒对照组及正常对照组IL-4水平相比,有显著差异(P＜0.05)。脾细胞上清中IFN-γ水平在DV/Pys48免疫组与空质粒对照组和正常对照组间,无明显差异(P＞0.05)。提示DV/Pys48免疫小鼠后,机体IFN-γ维持在正常水平,IL-4维持在较高水平。　　 5、核酸疫苗免疫小鼠脾细胞中DCs亚群的数量　　 DV/Pys48免疫组CD11C+CD11b+DCs(mDCs)的数量虽然高于空质粒对照组和正常对照组,但没有显著差异(P＞0.05)。脾细胞中CD11c+CD45R/B220+DCs(pDCs)的数量在疫苗免疫组出现有意义地升高,与空质粒对照组和正常对照组之间具有明显差异(P＜0.05)。　　 6、核酸疫苗免疫小鼠脾细胞中DCs胞内TLR9的表达水平　　 疫苗免疫组小鼠表达TLR9的CD11c+DCs的数量明显高于空质粒对照组和正常对照组,而空质粒对照组表达TLR9的DCs的数量与正常对照组间无明显差异。　　 7、核酸疫苗免疫小鼠后脾细胞中分泌IgG抗体的B细胞数量　　 核酸疫苗免疫小鼠后,脾细胞中分泌IgG抗体的B细胞数明显高于空质粒对照组和正常对照组(P＜0.05),且分泌IgG抗体的B细胞数在空质粒对照组与J下常对照组间无显著差异。　　 8、合子,动合子培养及计数　　 与对照组再感染Py17L相比,DV/Pys48免疫组再感染Py17XL后,其感染的血液经动合子培养基培养,可见合子和动合子的数量明显减少,具有显著差异。　　 结论：　　 1、成功构建间日疟原虫rPvs48原核表达系统,在体外可以大量表达目标蛋白。　　 2、纯化后的rPvs48经动物免疫证实具有良好的免疫原性。　　 3、rPvs48免疫血清中的抗体能特异性结合天然配子体表面抗原。　　 4、DV/Pys48确实具有良好的免疫原性,免疫小鼠后使机体的体液免疫功能维持在较高水平。　　 5、DV/Pys48免疫小鼠后可以建立有效的传播阻断效应。