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猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起猪病毒性腹泻的2种主要病原,同属于冠状病毒科α冠状病毒属,主要症状为呕吐、脱水、水样拉稀,各种年龄段的猪均容易感染,尤其对哺乳仔猪有严重的危害,感染率几乎为100%。2010年以来,PED以新的流行特点在我国多省爆发,发病严重、致死率高、防控困难,提示流行毒株可能发生了遗传变异,给养猪业造成极大的困扰。猪Delta冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是新发现的一种猪腹泻冠状病毒,属于δ冠状病毒属。它主要感染仔猪,引起的临床症状与TGE和PED极其相似,又极易发生混合感染,临床上难以区分。目前该病毒已在美国和加拿大、韩国、泰国以及我国均有检测到,而且感染范围正在逐步扩大,引起了全球养猪业的高度重视。因此,建立一种有效、方便、快捷的鉴别诊断方法,对预防和控制这几种病毒性腹泻病具有重要的临床意义。由于PDCoV、TGEV和PEDV的临床特征和病理变化非常相似,又多呈混合感染,临床上难以区分,因此需要借助实验室诊断方法。RT-PCR方法因具有敏感性好、特异性强等特点,现被广泛应用于病原的检测。尤其是多重RT-PCR方法既具有RT-PCR方法的优点,又可以达到快速、同时鉴别诊断多种病原的目的。因此,本研究建立了这3种病毒的单重、二重和多重RT-PCR鉴别诊断方法,并已证明具有很好的特异性和敏感性。具体研究内容如下:1.本研究根据GenBank中已发表的TGEV的N基因序列、PEDV的M基因序列、PDCoV的N基因序列,通过同源性分析,找出其保守序列,分别设计并合成3对特异性引物。通过优化RT-PCR反应条件和扩增程序,分别建立PDCoV、TGEV和PEDV的单重RT-PCR诊断方法,并对建立好的单重RT-PCR方法进行敏感性、特异性试验。试验结果表明所建立的方法对TGEV的最低检测量为368拷贝/μL,PEDV的最低检测量为388拷贝/μL,PDCoV的最低检测量为314拷贝/μL;该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒II型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等检测均为阴性,证明本试验建立的3个单重RT-PCR方法可以有效、准确的检测出这3种病毒,有利于这病原的早期诊断和预防。2.在已建立的单重PDCoV、PEDV、TGEV的RT-PCR基础上,通过对PCR反应条件和反应体系的优化,分别建立了PDCoV+TGEV、PDCoV+PEDV、TGEV+PEDV的双重RT-PCR检测方法。PDCoV+TGEV双重RT-PCR方法可同时扩增PDCoV的383 bp和TGEV的229 bp的特异性片段,最低检测量分别为314拷贝/μL和3.68×10~3拷贝/μL;PDCoV+PEDV的双重RT-PCR方法可同时扩增PDCoV的383 bp和PEDV的101 bp的特异性片段,最低检测量分别为3.14×10~3拷贝/μL和3.88×10~4拷贝/μL;TGEV+PEDV的双重RT-PCR方法可同时扩增TGEV的229 bp和PEDV的101 bp的特异性片段,最低检测量分别为368拷贝/μL、388拷贝/μL。这3种方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒II型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等检测均为阴性。说明该方法适合对PDCoV和TGEV、PDCoV和PEDV、TGEV和PEDV的混合性感染进行检测和鉴别诊断。3.在已建立的双重RT-PCR基础上,通过对扩增条件和反应程序的优化,在国内首次建立PDCoV、TGEV、PEDV的多重RT-PCR诊断方法,即利用一次RT-PCR反应,可同时扩增PDCoV的383 bp、TGEV的229 bp和PEDV的101 bp的特异性片段,最低检出量分别为3.14×10~3拷贝/μL,3.68×10~4拷贝/μL,3.88×10~4拷贝/μL,对PRRSV、PCV2、PRV等检测均为阴性。同时采用建立的方法对临床疑似样品进行检测,结果表明与单重RT-PCR、双重RT-PCR的检测结果一致。证明该方法适合对PDCoV、TGEV、PEDV的混合感染进行检测和鉴别诊断。