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【目的】
1.设计与合成一系列的嘧啶并吲哚衍生物，并对其反应条件进行探讨和优化。
2.将得到的中间体和目标化合物进行纯度分析和结构表征。
3.将得到的目标化合物进行初步的脐带血造血干细胞离体扩增活性评价，得出初步的构效活性关系，为深入研究其构效关系及作用机制，寻找离体扩增效应更好的小分子化合物研究打下基础。
【方法】
1.中间体5-(3-硝基苯基)-2H-四氮唑(B001)的合成：由间硝基苯腈与叠氮化钠在溴化锌的催化下回流反应，发生[2+3]偶极环加成得到四氮唑中间体B001。
2.中间体2-甲基-5-(3-硝基苯基)-2H-四氮唑(B002)的合成：由中间体B001与碘甲烷在碱性条件下加热反应得到。
3.中间体N-羟基-N-(3-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)苯基)乙酰胺(B004)的合成：通过镍粉/水合肼将B002的硝基部分还原为羟胺中间体，然后不经纯化直接将其用乙酰氯处理得到中间体B004。
4.中间体2-氨基-6-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-1H-吲哚-3-羧酰胺(B005)的合成：中间体B004在三乙胺存在下，冰浴的条件下与丙二腈发生[3,3]-σ重排后，再回流反应得到中间体B005。
5.中间体6-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-2-(2-苯基乙酰胺基)-1H-吲哚-3-羧酰胺(B006)的合成：由中间体B005在三乙胺的存在下与苯乙酰氯反应得到。
6.中间体2-苄基-7-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-3H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4(9H)-酮(B007)的合成：由中间体B006在叔丁醇钾的作用下加热回流脱水关环得到。
7.中间体2-苄基-4-氯-7-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚(B008)的合成：由中间体B007经三氯氧磷回流反应得到。
8.中间体2-(6,7-二甲氧基-3,4-四氢异喹啉)-乙二胺(C001)的合成：由3,4-二甲氧基苯甲醛与硝基甲烷缩合，经两步还原成相应的苯乙胺，经过Pictet-Spengler反应生成对应1,2,3,4-四氢异喹啉，然后在三乙胺作碱的条件下与Boc-溴乙胺反应，最后三氟乙酸脱去Boc后得到。
9.目标化合物(A001-A015)的合成：中间体B008四号位上的氯在无水碳酸钾的存在下经不同的氨基衍生物取代得到。
10.对所合成的中间体和最终产物，通过LC-MS，NMR等表征手段进行结构鉴定，用TLC，HPLC对中间体和目标产物进行纯度分析。
11.目标化合物的初筛：对CD34+/CD38-细胞进行标记后，通过流式细胞术对其的百分比进行测定。将多浓度范围内培养后的CD34+CD38-细胞比例拟合得到EC50值。
12.目标化合物A011扩增效果评价：使用流式细胞术评估目标化合物A011在最佳浓度范围下对HSPCs以及更原始的HSCs的扩增的效果，使用的免疫表型包含CD34+，CD38-，CD90+，CD45RA-，CD49f+。统计扩增效果并分析其最佳浓度。
13.目标化合物A011造血集落形成单位分析：细胞用目标化合物A011处理，接种在半固体MethoCultH4434培养基中，通过形态学对各谱系集落形成情况进行分类和评分。
14.目标化合物A011对细胞凋亡的评价：特异性标记CD34+CD38-细胞后使用Annexin-V法在流式细胞仪上测定细胞凋亡率。
15.人单核THP-1细胞系的CCK-8分析：将具有指数生长的细胞接种到板中，加入合适浓度的目标化合物A011培养，用CCK-8孵育后使用酶标仪测量吸光度。
【结果】
1.设计并合成出足够量的关键中间体和15个嘧啶并吲哚衍生物，并对其进行了纯度鉴定和结构表征。
2.初步筛选发现目标化合物A011作为该系列中促进CD34+和CD34+CD38-细胞扩增并维持扩增细胞干性上最有希望的化合物，此外，目标化合物A011能重新填充CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+长期造血干细胞并维持其干性。
3.目标化合物A011扩增的脐带血造血干细胞保留了造血集落形成单位的特性和足够的多谱系分化能力。
4.目标化合物A011不会诱导细胞凋亡且在高浓度时没有明显的细胞毒性。
【结论】
1.以嘧啶并吲哚环为母核合成出一系列新的衍生物，探索和优化了关键中间体及目标化合物的合成反应条件，并建立了一种新的目标化合物合成方法。
2.通过对目标化合物的扩增脐血HSCs效果进行筛选，发现了一种具有很好扩增效果的新型小分子化合物A011，并初步讨论了其构效关系。该化合物生物活性高，扩增效果佳，培养后的脐血HSCs保持着完整的多谱系分化潜力且生物安全性高。化合物A011是有前途的离体扩增剂之一，有进一步用于临床研究的可能性。
1.设计与合成一系列的嘧啶并吲哚衍生物，并对其反应条件进行探讨和优化。
2.将得到的中间体和目标化合物进行纯度分析和结构表征。
3.将得到的目标化合物进行初步的脐带血造血干细胞离体扩增活性评价，得出初步的构效活性关系，为深入研究其构效关系及作用机制，寻找离体扩增效应更好的小分子化合物研究打下基础。
【方法】
1.中间体5-(3-硝基苯基)-2H-四氮唑(B001)的合成：由间硝基苯腈与叠氮化钠在溴化锌的催化下回流反应，发生[2+3]偶极环加成得到四氮唑中间体B001。
2.中间体2-甲基-5-(3-硝基苯基)-2H-四氮唑(B002)的合成：由中间体B001与碘甲烷在碱性条件下加热反应得到。
3.中间体N-羟基-N-(3-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)苯基)乙酰胺(B004)的合成：通过镍粉/水合肼将B002的硝基部分还原为羟胺中间体，然后不经纯化直接将其用乙酰氯处理得到中间体B004。
4.中间体2-氨基-6-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-1H-吲哚-3-羧酰胺(B005)的合成：中间体B004在三乙胺存在下，冰浴的条件下与丙二腈发生[3,3]-σ重排后，再回流反应得到中间体B005。
5.中间体6-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-2-(2-苯基乙酰胺基)-1H-吲哚-3-羧酰胺(B006)的合成：由中间体B005在三乙胺的存在下与苯乙酰氯反应得到。
6.中间体2-苄基-7-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-3H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4(9H)-酮(B007)的合成：由中间体B006在叔丁醇钾的作用下加热回流脱水关环得到。
7.中间体2-苄基-4-氯-7-(2-甲基-2H-四氮唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚(B008)的合成：由中间体B007经三氯氧磷回流反应得到。
8.中间体2-(6,7-二甲氧基-3,4-四氢异喹啉)-乙二胺(C001)的合成：由3,4-二甲氧基苯甲醛与硝基甲烷缩合，经两步还原成相应的苯乙胺，经过Pictet-Spengler反应生成对应1,2,3,4-四氢异喹啉，然后在三乙胺作碱的条件下与Boc-溴乙胺反应，最后三氟乙酸脱去Boc后得到。
9.目标化合物(A001-A015)的合成：中间体B008四号位上的氯在无水碳酸钾的存在下经不同的氨基衍生物取代得到。
10.对所合成的中间体和最终产物，通过LC-MS，NMR等表征手段进行结构鉴定，用TLC，HPLC对中间体和目标产物进行纯度分析。
11.目标化合物的初筛：对CD34+/CD38-细胞进行标记后，通过流式细胞术对其的百分比进行测定。将多浓度范围内培养后的CD34+CD38-细胞比例拟合得到EC50值。
12.目标化合物A011扩增效果评价：使用流式细胞术评估目标化合物A011在最佳浓度范围下对HSPCs以及更原始的HSCs的扩增的效果，使用的免疫表型包含CD34+，CD38-，CD90+，CD45RA-，CD49f+。统计扩增效果并分析其最佳浓度。
13.目标化合物A011造血集落形成单位分析：细胞用目标化合物A011处理，接种在半固体MethoCultH4434培养基中，通过形态学对各谱系集落形成情况进行分类和评分。
14.目标化合物A011对细胞凋亡的评价：特异性标记CD34+CD38-细胞后使用Annexin-V法在流式细胞仪上测定细胞凋亡率。
15.人单核THP-1细胞系的CCK-8分析：将具有指数生长的细胞接种到板中，加入合适浓度的目标化合物A011培养，用CCK-8孵育后使用酶标仪测量吸光度。
【结果】
1.设计并合成出足够量的关键中间体和15个嘧啶并吲哚衍生物，并对其进行了纯度鉴定和结构表征。
2.初步筛选发现目标化合物A011作为该系列中促进CD34+和CD34+CD38-细胞扩增并维持扩增细胞干性上最有希望的化合物，此外，目标化合物A011能重新填充CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+长期造血干细胞并维持其干性。
3.目标化合物A011扩增的脐带血造血干细胞保留了造血集落形成单位的特性和足够的多谱系分化能力。
4.目标化合物A011不会诱导细胞凋亡且在高浓度时没有明显的细胞毒性。
【结论】
1.以嘧啶并吲哚环为母核合成出一系列新的衍生物，探索和优化了关键中间体及目标化合物的合成反应条件，并建立了一种新的目标化合物合成方法。
2.通过对目标化合物的扩增脐血HSCs效果进行筛选，发现了一种具有很好扩增效果的新型小分子化合物A011，并初步讨论了其构效关系。该化合物生物活性高，扩增效果佳，培养后的脐血HSCs保持着完整的多谱系分化潜力且生物安全性高。化合物A011是有前途的离体扩增剂之一，有进一步用于临床研究的可能性。