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目的:研究CKS1、CKS2调节肝癌细胞Hep G2增殖与凋亡的作用与机制,为肝细胞癌临床分子靶向治疗提供新的线索。方法:1.CKS1、CKS2基因干扰运用RNA干扰技术,对肝癌细胞Hep G2进行CKS1-si RNA、CKS2-si RNA转染后提取细胞RNA,应用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法分别检测CKS1、CKS2 m RNA表达水平。2.CKS促进肝癌细胞增殖的机制研究2.1 p27 mRNA水平和蛋白水平检测干扰CKS1、CKS2基因表达后,应用RT-q PCR和Western Blot技术分别检测p27 m RNA和蛋白水平的表达。2.2 p27蛋白稳定性检测干扰肝癌细胞Hep G2细胞中CKS1和CKS2表达后,用CHX(放线菌酮)抑制细胞蛋白合成,运用Western Blot技术检测p27蛋白水平,观察其蛋白半衰期的改变,分析CKS1、CKS2基因对p27蛋白稳定性的作用。2.3 p27蛋白泛素化检测通过体内泛素化实验(In vivo ubiquitination)分析干扰CKS1、CKS2基因表达后对p27蛋白泛素化的影响。2.4 CKS与p27相互作用检测运用免疫共沉淀的方法分析CKS1、CKS2与p27蛋白之间是否相互结合。3.CKS抑制肝癌细胞凋亡的机制分析3.1筛选可能相关的细胞凋亡基因。3.2干扰CKS1、CKS2基因表达后,应用RT-qPCR方法检测AIFM1等凋亡相关基因的表达水平。结果:1、肝癌细胞中CKS1、CKS2 RNA干扰24小时后,CKS1、CKS2 m RNA水平显著下降(分别下降73%和63%),差异具有统计学意义。2、干扰肝癌细胞Hep G2 CKS1、CKS2表达后,p27的m RNA水平没有明显改变,但其蛋白水平明显上调(>1.5倍),差异具有统计学意义。3、p27蛋白稳定性检测结果表明:分别干扰CKS1、CKS2基因表达后,p27蛋白半衰期和对照组相比显著延长,说明CKS1、CKS2确实参与p27蛋白水平的调控,即CKS促进p27蛋白的降解。4、体内泛素化实验结果显示:分别干扰CKS1、CKS2基因表达后,p27蛋白的泛素化降解均受到明显抑制。5、免疫共沉淀结果显示CKS1蛋白与p27蛋白能够相互结合。6、凋亡基因的筛选结果显示:干扰CKS1的表达后,凋亡诱导因子PMAIP1(NOXA)基因上调;干扰CKS2的表达后,凋亡抑制因子XIAP基因下调,凋亡诱导因子AIFM1和Bax基因上调。2、干扰肝癌细胞Hep G2 CKS1、CKS2表达后,p27的m RNA水平没有明显改变,但其蛋白水平明显上调(>1.5倍),差异具有统计学意义。3、p27蛋白稳定性检测结果表明:分别干扰CKS1、CKS2基因表达后,p27蛋白半衰期和对照组相比显著延长,说明CKS1、CKS2确实参与p27蛋白水平的调控,即CKS促进p27蛋白的降解。4、体内泛素化实验结果显示:分别干扰CKS1、CKS2基因表达后,p27蛋白的泛素化降解均受到明显抑制。5、免疫共沉淀结果显示CKS1蛋白与p27蛋白能够相互结合。6、凋亡基因的筛选结果显示:干扰CKS1的表达后,凋亡诱导因子PMAIP1(NOXA)基因上调;干扰CKS2的表达后,凋亡抑制因子XIAP基因下调,凋亡诱导因子AIFM1和Bax基因上调。结论:1、CKS1、CKS2对p27蛋白水平的调控均是通过增强其泛素化降解从而促进肝癌细胞Hep G2的增殖,而与p27的m RNA水平调控无关。其中,CKS2具有促进p27蛋白泛素化降解的作用为首次报道。2、在肝癌细胞Hep G2中CKS1蛋白与p27蛋白之间存在相互结合,CKS1可能通过与p27的相互作用促进其泛素化降解。3、CKS1可能通过p53非依赖的NOXA途径抑制细胞凋亡,CKS2可能通过XIAP、AIFM1等凋亡相关基因抑制细胞凋亡。