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口腔鳞状细胞癌(OSCC)是一类极具破坏性且致命的恶性肿瘤,在所有头颈部恶性肿瘤当中占有很大比例,已经成为人类健康的一大杀手。口腔鳞状细胞癌因为其特殊的解剖位置,常严重影响患者的生存质量且多数预后不良。人们的日常不良习惯,如吸烟和饮酒等是癌症转移的危险因素,而肿瘤的转移是癌症患者面临的一个严重问题。据统计,超过90%的癌症相关死亡率是由于转移。在口腔鳞状细胞癌当中,有超过50%的病人出现淋巴结转移,而这些患者的5年生存率显著下降。人类激肽释放酶基因家族(kallikrein,KLKs)是人类基因中最大的丝氨酸蛋白酶基因簇。KLKs是由15个不同基因编码的丝氨酸蛋白酶,其定位于人类染色体19q13.4上,是一组高度保守的基因结构和蛋白质序列。KLKs在多个组织器官中表达。在许多生理过程中KLKs都扮演着重要角色。最近,KLKs被报道在肿瘤生长和转移中发挥重要功能,并被认为是各种癌症的生物标志物。许多KLKs在各种恶性肿瘤中表现出异常表达,被认为是疾病发展的预后标志。目前的研究表明,KLKs与口腔鳞状细胞癌(OSCC)密切相关,涉及到肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移等诸多方面,而严重影响了人类的生命健康。KLK4是人类激肽释放酶基因家族中的一员,研究表明KLK4可以裂解肽键,这一特征对其在恶性肿瘤中的作用可能至关重要。研究认为KLK4对于恶性肿瘤具有重要的作用,KLK4可能通过促进细胞增殖、EMT以及恶性转化等途径促进癌的发生与进展。在1999年,KLK4首次由Stephenson等在子宫内膜癌c DNA文库中发现。对卵巢癌研究显示,KLK4与卵巢癌进展有关。另外,KLK4还在前列腺癌中也被过度表达,在肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)过程和前列腺癌骨转移过程中发挥重要作用。此外,KLK4在其他肿瘤如肾癌、喉癌等的发生发展中也起到重要作用。Wnt/β-catenin信号通路在口腔组织发育及相关疾病中也起着重要作用。β-catenin参与口腔鳞状细胞癌的发展,起着癌基因的作用。β-catenin的减少与不良预后有关,被视为口腔鳞状细胞癌复发的生物标志物。Wnt信号与细胞增殖、迁移、分化和存活有关。机体调节对Wnt的失控,将影响到癌症的进展。在恶性肿瘤当中,类似的调节机制还有PI3K/AKT信号通路等。本研究通过RNA干扰技术干扰KLK4基因在口腔鳞状癌细胞中的表达,探讨KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞增殖,凋亡,迁移侵袭能力的影响以及其相关分子机制。本研究分以下几部分进行:一、口腔鳞癌细胞培养、KLK4基因干扰质粒构建以及干扰效率验证:设计并合成KLK4基因的干扰片段和无关序列片段(si RNA for KLK4:5′-AATCCGTGTCCGAGTCTGAC-3′),将上述片段分别构建至p GCsi-H1的质粒中,获得p GCsi-H1-KLK4的干扰质粒和p GCsi-H1-NC的对照质粒,将质粒转染口腔鳞癌细胞KB、Tca-8113,用G418筛选,获得稳定转染p GCsi-H1-KLK4的细胞系和对照细胞系。通过q RT-PCR方法验证基因沉默效率。结果证实,干扰质粒得到了成功转染,并得到了稳定转染p GCsi-H1-KLK4的细胞系和对照细胞系;同时应用实时定量PCR的方法验证了KLK4基因的沉默效率。二、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞增殖的影响:通过MTT实验检测各组细胞增殖情况(连续检测5天)发现KLK4-sh RNA组细胞比纯细胞组和阴性对照组的细胞增殖能力显著下降。通过流式细胞术检测各组细胞周期发现KLK4基因干扰使口腔鳞癌细胞G1期比例显著增高,抑制口腔鳞癌细胞有丝分裂,从而抑制肿瘤细胞增殖。通过克隆形成实验检测体外成瘤能力发现KLK4沉默抑制了口腔鳞癌细胞的增殖和克隆形成。通过免疫荧光法检测PCNA的表达发现KLK4沉默后所有细胞中具有增殖能力的比例显著下降。以上结果均说明KLK4沉默显著抑制了口腔鳞癌细胞增殖。三、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞凋亡的影响:通过流式细胞术Annexin V/PI双染检测各组细胞凋亡发现KLK4 sh RNA组凋亡细胞比例显著增高。通过Hoechst染色检测凋亡细胞核变化,我们可以明显的观察到KLK4基因干扰组细胞凋亡比例显著增加,其中凋亡细胞可以明显观察到核染色质聚集。通过Western blot方法,我们检测了与细胞凋亡密切相关的cleave Caspase-3、cleave PARP、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平发现KLK4 sh RNA组中cleave Caspase-3、cleave PARP和Bax表达显著增高;同时,Bcl-2的表达显著降低。以上结果表明:KLK4基因沉默能够显著诱导口腔鳞癌细胞的凋亡。四、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭的影响:通过划痕实验检测细胞迁移能力显示KLK4沉默显著抑制了KB细胞和Tca-8113细胞的迁移。通过Transwell实验进行评估口腔鳞状细胞癌细胞的侵袭能力显示,经KLK4 sh RNA转染后,通过微孔基质膜的细胞数量显著减少,表明KLK4沉默抑制了口腔鳞状细胞癌细胞的侵袭性。通过明胶酶谱法和Western blot检测MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平,我们发现KLK4 sh RNA组MMP-2和MMP-9蛋白水平显著降低,表明KLK4沉默抑制了MMP-2和MMP-9的表达和活性。以上结果说明KLK4基因沉默能够显著降低口腔鳞状细胞癌的转移和侵袭。五、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞上皮间质转化(EMT)的影响:通过Western blot检测EMT的重要标志物E-cadherin,Vimentin,N-cadherin的蛋白表达水平,结果表明KLK4 sh RNA组细胞E-cadherin蛋白水平显著增高;而Vimentin和N-cadherin蛋白水平显著降低。通过Western blot检测EMT程的重要相关蛋白酶u PA、TIMP-1和TIMP-2的蛋白表达水平,结果表明KLK4 sh RNA组细胞u PA蛋白水平显著降低;而TIMP-1和TIMP-2蛋白水平均显著增高。以上结果表明KLK4能够促进肿瘤细胞的上皮间质转化(EMT)过程。六、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响:通过Western blot检测Wnt1和β-catenin蛋白水平发现KLK4 sh RNA组中Wnt1和β-catenin蛋白水平均显著下降。对β-catenin的表达和分布进行了免疫荧光检测显示KLK4 sh RNA组细胞的β-catenin均呈现低表达,说β-catenin进入细胞核也受到了KLK4 sh RNA的抑制。通过Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关产物GSK-3β、p-GSK-3β、cyclin D1和c-myc的表达发现GSK-3β蛋白水平在各组间无显著性差异,而KLK4 sh RNA组中p-GSK-3β、cyclin D1和c-myc的蛋白表达水平显著降低。以上结果为KLK4沉默对Wnt/β-catenin信号通路激活的抑制作用提供了进一步的证据。而加入Wnt/β-catenin信号通路激活剂SB216763后我们发现前面所有KLK4沉默所带来的效应均有所逆转。这说明了KLK4可通过Wnt/β-catenin信号通路发挥其致癌作用。七、KLK4基因干扰对口腔鳞癌细胞PI3K/AKT信号通路的影响:通过Western blot检测P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT的表达情况表明KLK4sh RNA组的P-PI3K和P-AKT蛋白水平显著降低,而PI3K和AKT蛋白水平无显著变化。同样的,KLK4 sh RNA组的P-AKT蛋白表达显著降低,而AKT蛋白表达无显著变化,说明KLK4沉默抑制了PI3K/AKT信号通路的激活。而加入PI3K/AKT信号通路激活剂740 Y-P以后,通过划痕实验、Transwell实验、明胶酶谱法及Western blot等检测手段发现原本KLK4沉默带来的效应亦得到部分逆转。以上结果说明KLK4可通过PI3K/AKT信号通路发挥其对恶性肿瘤的诱发和促进作用。根据以上实验研究,我们可以得到结论:KLK4基因干扰可以显著抑制口腔鳞癌细胞的增殖、转移和侵袭,并可促进口腔鳞癌细胞的凋亡。其机制在于KLK4沉默可抑制Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路的激活。这也揭示了KLK4作为一种口腔鳞状细胞癌的致癌基因,对其进行的靶向治疗,可能为我们攻克口腔恶性肿瘤的战斗中提供新思路、新武器。