基于NGF缓释的pH敏感可注射水凝胶的制备及其评价

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周围神经损伤是临床上的一种常见疾病。目前研究的重点是采用神经导管(Nerve conduits,NCs)来修复受损神经。然而中空神经导管往往由于缺乏生物活性物质等“微环境”物质的支持,取得的修复效果非常有限。本论文为制得中空神经导管的填充材料,改善神经再生的“微环境”,从“仿生”的设计思路出发,选择类细胞外基质成分壳聚糖(Chitosan,CS)和细胞外基质成分透明质酸(Hyaluronic acid,HA),利用HA上的-COOH与CS上的-NH2之间发生的酰胺交联反应,制备出一种响应生理pH完成凝胶化的CS-HA可注射水凝胶,并对其进行了表征。通过原位载药的方式将神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)在凝胶的制备过程中载入,获得了CS-HA/NGF水凝胶,研究了其体外释放性能和细胞相容性。最后将制备的CS-HA/NGF水凝胶通过注射填充于聚乳酸/β-磷酸三钙(PDLLA/β-TCP)中空神经导管中,制备了含有水凝胶的复合神经导管材料,进行了大鼠坐骨神经缺损修复的体内动物实验。采用试管倒置法表征了CS-HA可注射水凝胶的凝胶化时间、利用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)和扫描电子显微镜(SEM)表征了其结构和形貌、采用微机控制电液伺服万能试验机表征了其力学性能、通过称重法考察了其溶胀和降解性能。结果显示:在生理pH的作用下,通过改变水凝胶的组成,可使水凝胶在50s到6 min内完成凝胶化过程,能够较好地满足注射的需要;水凝胶的内部为连续的多孔网络结构,孔径可控,多孔隙的结构有利于细胞的生长以及NGF的粘附;力学性能测试表明其压缩模量较好;水凝胶在pH值为2.0-9.0的缓冲溶液中具有明显的pH敏感性,有利于药物的缓慢释放;在8周内的降解失重率可达到70%以上,具有较好的降解性能,有利于周围神经的再生。以牛血清蛋白为模型药物,采用考马斯亮蓝G-250法优化了CS-HA可注射水凝胶的处方工艺,并用该处方制备CS-HA/NGF可注射水凝胶,采用酶联免疫吸附法对NGF的释放性能进行了研究。结果显示:当CS和HA的质量比接近3:1时,水凝胶的累计释放量最高,NGF的释放周期为28天左右,累积释放率约为79.47%,CS-HA/NGF水凝胶可实现NGF的持续缓慢释放,有望为周围神经修复提供良好的微环境,促进神经再生。将RSC96大鼠雪旺细胞(RSC96)、骨髓间充质干细胞(BMMSCs)、肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)与CS-HA/NGF水凝胶共培养,采用CCK-8法评价了水凝胶的细胞毒性,采用细胞免疫荧光染色法以及扫描电镜图评价了细胞在材料表面的粘附和增殖情况,采用PC12细胞增殖法评价了水凝胶对NGF活性的保护作用。结果显示:CS-HA/NGF水凝胶无细胞毒性并且有利于RSC96细胞和BMMSCs细胞的粘附和生长,CS-HA/NGF水凝胶在1、7、14、21天的缓释液都可以在一定程度上促进PC12细胞的轴突分化,说明该水凝胶可以较长时间地维持NGF的活性。以PDLLA/β-TCP中空神经导管、复合CS-HA水凝胶以及复合CS-HA/NGF水凝胶的PDLLA/β-TCP神经导管、自体神经进行了大鼠坐骨神经10 mm缺损的修复实验,主要考察了大鼠术后1个月和3个月的再生神经以及腓肠肌的形态学和组织学。结果显示:含有CS-HA/NGF水凝胶的神经导管组对大鼠坐骨神经的修复效果显著优于中空神经导管组,且和自体神经移植组相近,可有效促进缺损周围神经的再生。研究结果表明,CS-HA/NGF可注射水凝胶可有效促进神经再生,在神经组织工程领域具有良好的应用前景。
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