研究背景:非血缘脐血造血干细胞移植（umbilical cord blood transplantation,UCBT）以其独特的优势,如供体获取方便、资源丰富、查询方便快捷,移植物免疫原性偏弱,已经成为异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）技术的重要体系之一。由于移植物的不同,UCBT的免疫重建体系与目前较为流行的HLA半相合造血干细胞移植具有根本上的区别。一方面限于脐带血细胞的数量,UCBT在早期的造血及免疫重建上存在一定的延迟,增加了感染等并发症的几率,甚至存在植入失败的风险;另一方面UCBT一旦植入成功,其移植物抗白血病（graft-versus-leukemia,GVL）效应并不弱于其他类型移植,甚至复发率要低于HLA全相合的同胞造血干细胞移植,但其移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）发生率却并不平行增高,甚至慢性GVHD发生率要远低于半相合造血干细胞移植。因此,研究UCBT的植入后免疫重建规律,探索其免疫重建的相关机制是进一步降低移植并发症,提高UCBT疗效的研究重点。急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）和急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是两种发病年龄相差较大的两组不同类型疾病,其中ALL是儿童最常见的恶性肿瘤,而AML则是老年患者常见的恶性肿瘤之一。二者的白血病细胞在本质上存在根本的区别,作为治疗手段之一的化疗方案也是完全不同,可在接受造血干细胞移植进行根治性治疗时的方案却基本一致,包括预处理方案和预防GVHD的方案等。目前临床上仅以体重为基础计算单位,在ECOG评分基础上进行预处理方案及GVHD防治方案的药物剂量调整。考虑二者的免疫重建基线不一,研究AML和ALL患者在接受UCBT术后的免疫重建规律和特点,分析其临床疗效及相关影响因素,对于精细化调整移植后免疫调节的治疗方案具有重要的指导价值。T细胞是UCBT术后免疫重建的重要组成部分,其不仅是GVHD和GVL效应的主体细胞,也参与感染的免疫防御。总结T细胞在移植后免疫重建过程中的规律对于揭示移植后免疫重建变化规律有着重要的参考价值。T细胞通过其表面的T细胞受体（T-cell receptor,TCR）特异性识别和结合抗原,TCR通常和CD3分子以复合物的形式存在细胞表面。TCR由α和β两条链组成,其中的高可变互补决定区域3（complementarity-determining region 3,CDR3）结构域是特异性结合抗原的核心结构,其结构中可变V区的多样性反映了 T细胞收到抗原刺激后扩增的动态。因此,动态检测TCR的CDR3结构域的V区利用率可以推断体内T细胞的功能变化,对于了解免疫重建过程中T细胞的变化具有重要意义。本论文通过二代测序手段动态检测UCBT术后CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR的β链-CDR3的V区和J区基因的变化,利用流式细胞技术监测T细胞、自然杀伤（natural killer,NK）细胞和调节性T（regulatory T,Treg）细胞的重建情况,同时结合临床信息对于免疫重建过程中T细胞的功能进行动态推测,为探索UCBT术后精细化管理免疫调节方案提供了理论依据。第一部分UCBT术后急性白血病患者免疫功能重建和临床疗效的对比分析一、研究目的:不同年龄段的患者的免疫功能和重建基线存在天然的区别,但是在接受UCBT时却使用相似的预处理方案和预防GVHD策略。由于不同年龄段的AML和ALL发病率不一样,关于UCBT治疗AML和ALL的疗效对比,目前也仅有一项对1岁以内患儿的疗效对比研究。为此,我们对不同年龄段的急性白血病进行UCBT的疗效对比,随后对不同年龄段的AML和ALL患者再次进行疗效对比分析,同时进行免疫重建的数据对比研究,以期对不同年龄段患者可以分类型进行UCBT总方案的精细化调整。二、研究方法:2011年11月至2018年7月在本移植中心行单份UCBT的112例AML和194例ALL患者纳入该临床研究。对40岁以下的患者按年龄分组为:≤14岁和15-39岁,其中年龄在15-39岁组为青少年和年轻成人组（adolescents and young adults,AYAs）。脐血（cord blood,CB）的选择以HLA4/6～6/6相合的总有核细胞数（total nucleated cell,TNC）和CD34+细胞数为依据。AML和ALL患者的预处理方案均为清髓性预处理。对于年龄≤14岁或移植前接受放疗的患者,预处理方案在BU（busulfan）加环磷酰胺（cyclophosphamide,CY）（Bu:0.8 mg/kg,q6h,×4 天;CY:60mg/kg,qd,×2天）的基础上氟达拉滨（fludarabine,FLU）（30mg/m2,×4天）。对于≥14岁或复发或原发病诱导失败后未缓解的患者,预处理方案以全身照射（total body irradiation,TBI）加CY（TBI:12gy,分4组;CY:60mg/kg,qd,×2天）为基础,联合大剂量阿糖胞苷（cytarabine,Ara-C）（2.0g/m2,q12h,×2天）。干细胞输注后第6天开始皮下注射粒细胞集落刺激因子（5ug/kg.d）。GVHD的预防方案是环孢霉A联合霉酚酸酯。在UCBT后第30、60、90、120、180和360天采集外周血样本进行免疫重建指标的评估。首先对比AYAs组和儿童组急性白血病的中性粒细胞和血小板的累积植入率,总生存率（overall survival,OS）,无 GVHD 和无复发的生存率（GVHD-free/relapse-free survival,GRFS）,非复发死亡率（non-relapse mortality,NRM）,复发率,急性 GVHD（acute GVHD,aGVHD）和慢性GVHD（chronic GVHD,cGVHD）,随后再对不同年龄组的AML和ALL患者进行以上疗效指标的对比分析,并进行多因素分析。三、研究结果:1.患者的基本信息和移植情况:纳入自2011年11月到2018年7月的306例急性白血病患者进行分析,其中112例（36.6%）为AML,194例（63.1%）为ALL。AML患者的中位年龄为13.87岁（范围1-64岁）,ALL患者的中位年龄为11.89岁（范围1-50岁）。接受BUCY2/FLU预处理方案的203例（66.3%）,其中69例为AML,134例为ALL;103例（33.3%）预处理方案为TBI/CY/Ara-c,其中43例为AML,60例为ALL。AML患者的回输TNC和CD34+细胞数的中位数分别为4.25×107/kg（1.71-17.27×107/kg）和 2.18×105/kg（0.45-10.55×105/kg）。所有患者的 TNC 和 CD34+细胞数的中位数分别为 4.22×107/kg（1.69-13.5×107/kg）和 2.25×105/kg（0.4-8.53×105/kg）。按年龄分段进行分组,在AYAs组的接受UCBT中位年龄为23（15-39）岁,儿童组则为8（3-14）岁。AYAs组患者的回输TNC和CD34+细胞数的中位数分别为2.98×107/kg（1.69-7.4×107/kg）和 1.75×105/kg（0.4-7.77×105/kg）。儿童组的 TNC 和 CD34+细胞数的中位数分别为 5.38×107/kg（1.96-17.27×107/kg）和 2.75×105/kg（0.62-10.55×105/kg）。本研究所有入组患者的中位随访时间为21.6（3-80.7）个月。2.主要疗效指标的研究结果:AML患者的2年OS与ALL患者相似（72%,95%CI:62-79.4%,vs.66%,95%CI:59.5-70.3%,P=0.263）。ALL 和 AML 患者的 2 年 GRFS 分别为 63.1%（95%CI:52.9-71.7%）和 56.2%（95%CI:48.7-63.0%）,二者无明显差异（P=0.192）。儿童组的 2 年 OS（71%,95%CI:64-77%）和 AYAs 组（66%,95%CI:57-74%）类似（p=0.297）,2 年 GRFS（AYAs:56%,95%CI:46-65%;children:61%,95%CI:53-68%）也类似（p=0.529）。3.次要疗效指标的研究结果:3.1 中性粒细胞的 30 天累积植入率（AYAs:95%,95%CI:88%-98%;Children:95%,95%CI:90%-97%,p=0.001）和血小板 120 天累积植入率（children:88%,95%CI:80-92%;AYAs:80%,95%CI:71-87%,p=0.037）在AYAs组和儿童组之间相似,但是儿童组的恢复速度要快于AYAs组。AYAs组AML的中性粒细胞30天累积植入率（AML:97.9%,95%CI:76.8-99.8%;ALL:91.1%,95%CI:78.7-96.4%,p=0.02）和血小板 120 天累积植入率（AML:87.2%,95%CI:72.8-94.3%;ALL:73.2%,95%CI:59.2-83.1%,p=0.03）均高于ALL,CD34+细胞数量和预处理方案是影响中性粒细胞恢复的独立因素,同时CD34+细胞数量也是影响血小板植入的独立因素。AML与ALL的植入率在儿童组无显著性差异。3.2 aGVHD（Ⅱ-Ⅳ 级和 Ⅲ-Ⅳ 级）累积发生率在儿童组（Ⅱ-Ⅳ 级:17%,95%CI:12-22%;Ⅲ-Ⅳ 级:11%,95%CI:7-15%）和 AYAs 组（Ⅱ-Ⅳ 级:14%,95%CI:8-21%;Ⅱ-Ⅳ 级:8%,95%CI:4-14%）类似。2年cGVHD累积发生率在AML和ALL两组中按年龄分组和不分组时均类似。3.3 ALL患者2年内的累积复发率在不以年龄分层的情况下高于AML患者（ALL:24%,95%CI:17.9-30.6%;AML:10.1%,95%CI:5.1-17.1%,p=0.01）。按年龄分组分析,AYAs 组 AML 和 ALL 的累积复发率（AML:9%,95%CI:5.3-15.8%;ALL:25%,95%CI:1.4-37.1%,p=0.02）和中位复发时间均有显著性差异,儿童组的AML与ALL之间的复发率则无显著性差异。多因素分析显示cGVHD是影响复发的独立因素。3.4 AYAs 组的 NRM 比儿童高（AYAs:26%,95%CI:18-35%;children:15%,95%CI:10-20%,p=0.008）,预处理方案是独立影响因素。AML和ALL两组NRM（AML:21.4%,95%CI:14.1-29.7%;ALL:18.1%,95%CI:13.0-23.9%,p=0.738）在不以年龄分组时无差别,按年龄分组也无差别。3.5儿童组和AYAs组的CD4+、CD8+和Treg细胞随着时间的推移而恢复,其中NK细胞恢复最快。在儿童组,AML患者的CD4+T细胞在术后2个月低于ALL,而Treg细胞计数则在术后4个月高于ALL,CD8+T细胞和自然杀伤细胞在AML和ALL之间无明显差异,CD4+/CD8+T细胞比例在CBT后2个月最低,4个月时恢复正常。在AYAs组,AML患者在UCBT术后4个月时的CD8+T细胞数高于ALL,而CD4+T、Treg和NK细胞数与ALL无差异,CD4+/CD8+T细胞比例在CBT后3个月最低,12个月恢复正常。四、研究结论:在进行年龄分组对比后发现儿童组的AML和ALL患者接受UCBT的疗效类似,年轻成人组的AML的治疗疗效略好于ALL。在免疫重建方面,年轻成人组的CD8+T细胞在AML中重建略优于ALL,提示CBT是适合各年龄段急性白血病患者的非血缘干细胞移植选择之一。第二部分利用NGS检测TCR-CDR3对UCBT术后T细胞重建进行动态分析一、研究目的:UCBT术后GVHD和GVL效应相互制衡,且存在植入前综合征（pre-engraftment syndrome,PES）的特殊表现,最终形成复发率低,同时cGVHD发生率也低的临床效果。T细胞作为GVHD和GVL的主体细胞,探明其在移植后的重建过程对于揭示GVHD和GVL天然分离具有重要的指导意义。T细胞的特异性作用主要依靠其表面的TCR与抗原结合而启动,其中TCR的CDR3是实现特异性的主要结构,并以β链尤为重要。我们利用二代测序技术（NGS）对UCBT术后患者CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3基因进行动态检测,同时利用流式细胞术动态监测CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、Breg细胞和NK细胞变化,并结合临床事件进行分析,以期发现UCBT术后T细胞免疫重建的部分规律。二、研究方法:2017年12月至2018年12月在本移植中心行不含ATG的单份UCBT的7例AML和5例ALL患者纳入该临床研究。年龄分组为:≤14岁和15-39岁。12例患者均采用以化疗为基础的预处理方案（BU/CY2+FLU）,其余处理均和第一部分研究中的移植方案相同。在脐血回输当天留取复温后的脐血标本,在第3、6、9、12、18月左右的时间点采集外周血样本进行CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3进行NGS测序,对TCR-β链-CDR3的V区和J区进行利用率、唯一CDR3（unique-CDR3,uCDR3）、多样性指数D50（Diversity 50,D50）的计算,同时采用流式细胞术监测患者的T、NK和T-reg细胞变化,并结合临床事件,包括PES,aGVHD,巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）感染和复发进行综合分析。三、研究结果:1.入选患者的移植资料以及TCR-β链-CDR3的总体信息12例急性白血病患者7例为AML7,5例为ALL。儿童有4例,其中AML和ALL各2例;年轻成人有8例,其中AML5例,ALL3例。3例患者复发,其中1例为儿童ALL,1例成人AML和1例成人ALL。12例患者均留取脐血标本并接受了移植后3个月的检测,10例患者接受移植后6个月的检测,6例患者接受移植后9个月的监测,5例患者接受12个月的监测,1例患者接受18个月的检测。TCR-β链-CDR3-V区基因组库的总体信息显示不论是CD4+T细胞还是CD8+T细胞的TCR组库均随着时间具有波动性,且个体之间存在一定的差异性。2.CB的CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的NGS结果分析脐血CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3-V区利用频次前十位均和健康人有所重叠。两种T细胞的TCR-CDR3-BV和的TCR-CDR3-BJ家族各组之间的利用率均没有性别的差别。脐血CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3-V区的基因利用文库不一样,前者的基因利用率分布宽度比健康人群大,而后者则与健康人群类似。两种T细胞的TCR-β链-CDR3的shared-uCDR3比例和D50相似,且均没有性别的差异。3.UCBT术后3月时外周血CD4+T和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的NGS结果3.1 CD4+T和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的基因组库利用率分析在儿童组的AML和ALL患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3-J区和V区的基因组库利用率在个体之间差别不大,发生了 PES和CMV的患者的基因组利用频次和未发生组也类似。在年轻成人组的AML和ALL患者中,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3-J区和V区的基因组库利用率在个体之间类似,发生了 PES和CMV的患者的基因组利用频次和未发生组也无明显差异。儿童组的AML和ALL患者之间的基因组库利用频次率类似,年轻成人组的两组疾病的患者之间的基因组库利用频次率类似,但年轻成人组的利用频次整体高于儿童组。3.2 CD4+T 和 CD8+T 细胞的 TCR-β链-CDR3-V 区的 D50 分析年轻成人组的AML患者中,复发患者在UCBT术后3月时的CD4+T细胞的TCR-β链-CDR3-V区的D50最低,仅出现PES的患者的D50最高,而CD8+T细胞的D50在同时存在PES和aGVHD以及CMV感染时最高,同时存在PES和aGVHD最低,且整体水平低于CD4+T细胞。年轻成人组的ALL患者中,复发患者CD4+T细胞的D50最高,而CD8+T细胞的D50因整体水平偏低而无统计学意义。儿童组AML患者中,1例同时发生了 PES和CMV感染的CD4+T细胞和CD8+T细胞的D50均减低。在儿童组ALL患者中,存在aGVHD和复发的患者的CD4+T细胞的D50较高,而CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3-V区的D50则较低。3.3 CD4+T 和 CD8+T 细胞的 TCR-β链-CDR3-V 区的 Diversity index 分析年轻成人组AML患者中,复发患者的CD4+T细胞的diversity index最低,仅出现PES的患者的diversity index最高,CD8+T细胞的diversity index则在同时存在PES和aGVHD以及CMV感染时最高。在年轻成人组ALL患者中,复发患者的CD8+T细胞的 diversity index 则最低。儿童组AML患者中,同时发生PES和CMV感染的患者的CD4+T和CD8+T细胞的diversity index明显偏低。在儿童组的ALL患者中,存在aGVHD和复发的患者的CD4+T 细胞的 diversity index 较高,而 CD8+T 细胞的 diversity index 则较低。3.4 CD4+T 和 CD8+T 细胞的 TCR-β链-CDR3-V 区的 share u-CDR3 分析年轻成人组的AML患者中,复发患者的CD4+T细胞的shared u-CDR3比例最高,仅出现PES者的shared u-CDR3比例最低,CD8+T细胞的shared u-CDR3比例存在个体差异。年轻成人组的ALL患者中,复发患者的CD4+T细胞的shared u-CDR3比例最低,而CD8+T细胞的shared u-CDR3比例偏高,且CD8+T细胞的shared u-CDR3的比例整体高于CD4+T细胞。儿童组的AML患者中,同时发生PES和CMV感染的患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞的shared u-CDR3比例偏高。在儿童组的ALL患者中,存在aGVHD和复发患者的CD4+T细胞和CD8+T细胞的shared u-CDR3比例偏高,且CD8+T细胞的shared u-CDR3整体比例高于CD4+T细胞。4.UCBT术后发生PES和aGVHD时外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞的TCR-CDR3-β链的NGS结果和免疫重建结果PES发生组患者在移植后3个月的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的比例均比未发生组偏高,但并无统计学意义。两种T细胞的TCR-β链-CDR3的shared-uCDR3比例和D50在两组患者之间无明显差别。发生aGVHD组的患者在移植后3个月的CD4+T细胞和NK细胞比例较未发生aGVHD组略低,而CD8+T细胞比例略高,但均无统计学意义。移植后3个月发生aGVHD组两种T细胞TCR-β链-CDR3的shared-uCDR3比例比脐血状态明显增高,同时D50比脐血初始D50减低。发生aGVHD组患者的外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的shared-uCDR3和未发生组相比均无差别。发生aGVHD患者的CD4+T细胞TCR-β链-CDR3的D50略低于无aGVHD患者,而CD8+T细胞的D50则和无aGVHD患者类似,但其整体D50水平比CD4+T细胞还低。上一部分研究发现CD4/CD8比值在移植早期偏低,本部分研究的NGS结果分析显示移植后3个月时CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的D50比CD4+T细胞明显减低,且CD4/CD8比值恢复越早的患者预后越好。5.UCBT术后发生CMV感染和复发时外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞的TCR-CDR3-β链的NGS结果和免疫重建结果移植后3个月的CD4+T细胞的TCR-β链-CDR3的shared-uCDR3比例和D50在近期发生CMV感染和未发生组之间无明显区别,而CMV感染组的CD8+T细胞的shared-uCDR3比例虽然较未感染组高,其D50却和未感染者之间无统计学差异。在CMV感染患者中,移植后3个月的CD8+T的TCR-β链-CDR3的D50比CD4+T细胞明显减低。1例成人复发者的外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的D50持续较低,最终微小残留病转阳。1例儿童复发者的外周血的CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的D50与另一例恢复良好患儿相比明显减低。1例成人患者持续肺部感染,多次CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的D50也是持续偏低。UCBT术后cGVHD发生率较低,仅1例,因死亡未能完成监测。四、研究结论:1.本研究发现T淋巴细胞的TCR组库的利用频次在相同年龄段没有明显差别,但是年轻成人组的利用频次要高于儿童组。D50、diversity index和shared u-CDR3在移植后具有动态变化,可作为临床事件的预测指标。2.PES的发生不影响TCR-β链-CDR3的多样性变化,提示PES的反应中T细胞没有发挥特异性反应,结合我中心对PES的机制研究成果,再次印证UCBT术后早期反应以CB来源的单核细胞为主。3.UCBT后即使出现aGVHD,CD4+T细胞和CD8+T细胞的TCR-β链-CDR3的的多样性也无明显变化,同时研究发现PES后发生aGVHD时的T细胞的多样性改变不大,提示T细胞发挥的特异性作用不强,且随着时间的延长,cGVHD发生率偏低。该结果提示CBT的核心反应在早期的PES,并从免疫学角度揭示了 UCBT后cGVHD弱的可能机制。4.UCBT患者发生CMV感染时CD4+T细胞TCR-β链-CDR3的多样性无明显变化,而CD8+T细胞的多样性明显减低,提示CD8+T细胞发挥出特异性作用,反映出UCBT后免疫重建后的T细胞对病原体有良好的反应,重建了较强的免疫防御功能。