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假尿苷合酶在生物体的生长发育过程中发挥着重要的作用,其功能缺失后会导致动物发育迟缓、不育、甚至严重疾病等。目前,假尿苷合酶发挥作用的分子机制仍不清楚,特别是其对植物体生长发育的影响及作用机制的研究报道极少。本研究以水稻中假尿苷合酶编码基因发生突变的ospus1突变体为研究对象,综合利用遗传学、生物化学、转录组学、生物信息学和分子生物学等研究手段,力图解析假尿苷合酶调控植物RNA生物合成及水稻生长发育的分子机制。 我们研究的突变体ospus1为低温敏感叶色突变体,即在22℃生长温度下,ospus1叶片叶绿素的含量极低,约为野生型9311的3%。利用透射电镜对22℃生长温度下ospus1中叶肉细胞的超微结构观察发现,叶肉细胞内普遍缺少叶绿体,只有个别细胞中存在少量发育不良的叶绿体。因此,低温条件下叶绿素含量的减少和叶绿体的缺失是造成ospus1叶片白化的直接原因。遗传分析表明,ospus1突变体表型是由单隐性核基因突变造成的。通过图位克隆将ospus1的表型控制基因定位在了水稻第3染色体,随后的转基因遗传互补实验表明假尿苷合酶编码基因OsPUS1是ospus1的表型控制基因。OsPUS1在水稻各种组织中均表达,但在绿色组织如叶片中相对表达量较高;此外,OsPUS1的表达还受到低温诱导。亚细胞定位结果显示,OsPUS1在细胞叶绿体中定位。 进化分析表明,OsPUS1是植物中非常保守的一种蛋白质,与拟南芥中的假尿苷合酶SVR1为同源蛋白,并且两者的氨基酸序列相似性达59%。转录组数据和qRT-PCR结果表明,22℃低温条件下,OsPUS1的突变影响了ospus1中叶绿素代谢、叶绿体发育及光合作用等过程中相关基因的表达。Northern blot结果显示,22℃低温条件下,OsPUS1的突变导致水稻叶绿体基因组rrn操纵子上rRNA基因和tRNA基因所编码的4种成熟rRNA(16S、23S、4.5S和5S rRNA)和3种成熟tRNA(tRNA-I、tRNA-A和tRNA-R)的积累量减少,但并不影响核基因编码的细胞质rRNA(18S、25S和5S rRNA)的积累。其中,加工的缺陷导致了ospus1中成熟16S rRNA、23S rRNA和4.5S rRNA的数量低于野生型9311。 22℃低温条件下,生长在含壮观霉素和氯霉素培养基上的ospus1表现为对抗生素不敏感和叶片颜色表现出部分恢复。另外,多聚核糖体在蔗糖密度梯度上的分布特征表明,与野生型9311相比,低温条件下ospus1突变体中缺少一个吸收峰,并且其他位置的吸收峰的峰值偏高。根据上面两个实验结果,我们认为低温条件下OsPUS1的突变导致了ospus1质体rRNA加工的异常和成熟质体rRNA积累的减少,使得(1)核糖体的结构发生了改变,导致ospus1对抗生素不敏感。(2)核糖体的组装发生了异常。核糖体结构的改变与组装的异常严重影响了其蛋白质翻译能力,导致参与叶绿素合成、质体转录与翻译系统的建立和光合作用机器组装等叶绿体发育相关途径的蛋白质不能翻译,叶绿体发育异常,最终ospus1叶片表现为白色。 通过大规模遗传筛选,我们获得了18个ospus1抑制子(suppressor of ospus1,sop),遗传分析表明其中10个sop的表型是由单隐性核基因突变造成的。目前,通过基因定位结合大规模测序已经克隆了其中4个SOP基因,为进一步解析OsPUS1基因调控网络提供了线索。 本论文首次在水稻中研究了假尿苷合酶的功能。OsPUS1编码水稻中的假尿苷合酶,研究发现OsPUS1参与了水稻叶绿体基因组rrn操纵子上4种rRNA基因及3种tRNA基因所编码的质体rRNA和tRNA的生物合成。低温条件下,OsPUS1的突变首先影响了质体rRNA和tRNA的生物合成,随后影响了质体核糖体的结构与组装,核糖体结构的改变与组装的异常严重影响了其蛋白质翻译能力,导致参与叶绿素合成、质体转录与翻译系统的建立和光合作用机器组装等叶绿体发育相关途径的蛋白质不能翻译,叶绿体发育异常,最终导致ospus1的低温敏感叶色表型。随着SOP基因的克隆和功能解析,我们对OsPUS1调控RNA生物合成及水稻生长发育的分子机制会有更清晰的认识。