GSDMD及细胞焦亡在脓毒症相关ICU获得性衰弱中的作用研究

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背景:ICU获得性衰弱(ICU-acquired weakness,ICU-AW)是指危重症特别是严重脓毒症患者在疾病进程中出现的以神经肌肉功能障碍为病理基础、以全身疲乏无力为临床表现的综合征。ICU-AW是危重症患者的常见并发症,不仅影响患者的预后,严重降低了危重症幸存者的生活质量,还增加了危重症相关并发症的发生率,延长ICU治疗和康复时间,并在世界范围内大大增加了重症监护治疗的成本。但目前ICU-AW的发病机制尚未明确,寻找预防和治疗脓毒症相关的ICU-AW有效方法已成为当前重症医学领域亟待解决的科学问题。目的:本研究基于前期的研究基础,针对当前ICU-AW发病机制不明的问题,拟通过建立脓毒症相关的ICU-AW小鼠模型及对应的肌管损伤模型,从在体水平和细胞水平观察GSDMD及其介导的细胞焦亡在脓毒症相关ICU-AW中的作用,探索GSDMD及其介导的细胞焦亡在脓毒症相关ICU-AW发生发展中的可能机制,为脓毒症相关的ICUAW防治提供新的理论基础和依据。方法:为了探索脓毒症引起的ICU-AW发生机制,我们首先通过不同浓度的LPS腹腔注射建立脓毒症小鼠模型,对造模后96h和2wk生存小鼠进行研究。观察小鼠96h-2wk的生存率、体重、脾重变化,血常规检测小鼠外周血炎性指标,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠骨骼肌和各脏器炎性细胞浸润情况,通过以上指标首先确定脓毒症小鼠模型已成功构建。随后用q PCR法检测模型小鼠骨骼肌中萎缩基因Atrogin-1和Mu RF-1 m RNA表达量,肌肉力量生物换能器(BL-420S)检测模型小鼠骨骼肌收缩功能,评价模型小鼠是否罹患ICU-AW相关病理征象。同时,为了进一步探索细胞焦亡与脓毒症相关ICU-AW的相关关系,我们通过q PCR检测小鼠骨骼肌中细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18 m RNA表达水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-1β和IL-18的释放量,免疫荧光和免疫组织化学染色法定位骨骼肌中细胞焦亡标志性蛋白GSDMD表达,并通过透射电镜观察各造模小鼠骨骼肌中线粒体结构变化。此外,为了从细胞层面观察细胞焦亡对骨骼肌萎缩的影响,我们在体外分化培育肌管并用LPS/LPS+ATP刺激成功构建肌管损伤模型,通过q PCR检测小鼠骨骼肌肌管中萎缩基因Atrogin-1、Mu RF-1 m RNA的表达和细胞焦亡相关炎症因子IL-18 m RNA的表达,ELISA法检测肌管培养上清中IL-18的浓度,Western Blot法检测小鼠骨骼肌肌管中GSDMD的表达量。结果:1.在体研究结果:在相同造模时间内,不同LPS浓度腹腔注射的脓毒症模型小鼠生存率与LPS注射浓度有关;随着造模时间延长模型小鼠生存率变化渐趋于稳定且体重呈回升趋势;脓毒症模型小鼠炎性指标较对照组明显增高,形态学可观察到骨骼肌及各脏器组织炎性细胞浸润增多,且模型小鼠骨骼肌线粒体结构较对照组明显异常;模型小鼠骨骼肌收缩功能下降,骨骼肌萎缩基因Atrogin-1和Mu RF-1 m RNA表达较对照组显著增加,符合脓毒症相关ICU-AW评价;在脓毒症相关ICU-AW模型小鼠骨骼肌中,细胞焦亡相关炎症因子IL-1β和IL-18不仅m RNA表达量明显增加且在血清中大量释放,同时免疫荧光和免疫组化结果可见模型小鼠骨骼肌中细胞焦亡标志蛋白GSDMD显著表达。2.体外研究结果:光镜下可见分化后小鼠骨骼肌肌管形态,Western Blot检测结果示各组肌管中肌管形成标志蛋白均可稳定表达;LPS/LPS+ATP干预后各组肌管中萎缩基因Atrogin-1和Mu RF-1 m RNA表达量增加,且细胞焦亡相关炎性因子IL-18m RNA表达量及肌管培养上清中IL-18浓度均显著增加,同时,Western Blot检测可见LPS/LPS+ATP干预后各组肌管中GSDMD表达量增加。结论:本研究以上结果证实,在危重症脓毒症小鼠体内,细胞焦亡可能通过直接或间接调控炎症反应,引起骨骼肌收缩功能下降、肌肉萎缩和线粒体结构异常等病理改变,进而促进ICU-AW的发生、发展。同时,体外研究结果证实,在LPS/LPS+ATP刺激下肌管中发生了细胞焦亡,其严重程度与肌管萎缩基因的表达量相关,进一步为炎症所致肌肉萎缩的发生机制提供了理论依据。综上,本研究证实GSDMD及其介导的细胞焦亡可能参与了脓毒症相关ICU-AW的发生发展,为后续脓毒症相关ICU-AW的发病机制研究提出新的方向。
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