目的：　　 汉坦病毒(hantavirus,HV)是布尼亚病毒科(bunyavirida)汉坦病毒属(genushantavirus)的成员,为单股负链RNA病毒,由大(L)、中(M)和小(S)三个基因片段组成,分别编码病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。其包膜糖蛋白是病毒的毒力位点、中和抗原位点、型特异性抗原位点和血凝抗原位点所在,可刺激机体产生中和抗体,对感染动物和人体产生保护作用,是病毒致病性和疫苗研究的重点。　　 HV主要潜伏于黑线姬鼠、褐家鼠等啮齿类动物体内,可通过呼吸道、消化道或直接接触等途径感染人体,引起人类肾综合症出血热(hemorrhagic fever withrenal syndrome,HFRS)和汉坦病毒肺综合症(Hantavirus pulmonary syndrome,HPS)。我国是HFRS高发地区,己有30个省市被证实为本病的疫区,迄今累计发病人数近180万,占世界总发病数的90％以上。HFRS好发人群多是青壮年,并发症多,而且治疗困难,病死率高达1～15％。目前HFRS的抗病毒药尚未取得令人满意的效果。因此,疫苗的研制对HFRS防治具有重要的现实意义。　　 传统的疫苗研制方法(灭活疫苗、减毒活疫苗以及亚单位疫苗等)都具有许多无法克服的缺点:研制周期长;不适用于在体外无法培养的病原体;存在不安全因素(减毒活疫苗可由于病毒毒力返祖而致病);疫苗只对某一血清型或亚型的病原体有效,而不能抵抗异型病原体的侵袭。我国目前临床广泛应用的是HV双价灭活疫苗,主要针对汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(seroul virus,SEOV)开发研制,由于其研制周期长,保护范围窄,对发生变异的HNTV、SEOV和HV其他亚型不能起到有效的预防作用。多表位DNA疫苗的出现克服了传统疫苗的缺陷,为病毒疫苗的研究开辟了一条新思路。多表位疫苗是以反向疫苗学理论为基础,将多个抗原表位基因以适当的方式串联后重组至真核表达载体而制成。它可同时携带多个相关的抗原表位,包含信息量大,在应对血清型多、变异快的病毒病方面有着极大的优势,是基因工程蛋白质疫苗、核酸疫苗及抗体疫苗等新形式的分子疫苗的进一步发展。在筛选策略上,人们建立了人工预测法来提高抗原表位的筛选及鉴定效率。借助于计算机编制的预测软件,能够精确地预测抗原表位,减少盲目性,提高实验的成功率,已在多种病毒疫苗开发研制中取得了成功。　　 已知与HFRS相关的HV亚型有四种:HTNV、SEOV、普马拉病毒(puumalavirus,PUUV)和多布拉伐病毒(dobrav virus,DOBV)。中国境内已发现HTNV、SEOV、PUUV等三种亚型,其中HTNV、SEOV是我国HFRS的主要病原体,变异较快,我国大部分地区为这两型病毒混合型感染区;PUUV以往只流行于欧洲部分地区,近年来在吉林省抚松地区棕背鼠体内发现,具有潜在的流行趋势。　　 本研究采用生物信息学软件对HTNV、SEOV、PUUV包膜糖蛋白G2的抗原表位进行了分析和预测,共筛选出T细胞和B细胞表位25段。将这些表位串联在一起构成多表位嵌合基因——HSP基因。在设计多表位HSP基因的同时引入了免疫刺激序列CpG(GACGTT),以进一步提高其免疫活性。将HSP基因插入真核表达载体构建了HSP多表位DNA疫苗pcDNA3.1-HSP,然后通过体内和体外实验来检测其抗原性和免疫活性。为进一步探寻HSP多表位疫苗的最佳免疫效果,我们还设计了蛋白疫苗和DNA疫苗联合免疫的策略,期望找到一个更好的免疫方式,使疫苗的免疫效果达到最佳。鉴于有学者担心DNA疫苗有整合到宿主细胞染色体的安全性问题,我们对HSP多表位疫苗在动物体内的分布及其整合安全性进行了分析。　　 方法：　　 一、HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2抗原表位预测及HSP基因的设计与合成　　 (一)预测HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2抗原表位　　 采用在线预测网站Bcepred(http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/)、Expasy(http://us.expasy.org/)、ProPred(http:/www.imtech.res.in/)及IEDB AnalysisResource对HNTV、SEOV和PUUV包膜糖蛋白G2的抗原表位进行分析和预测。　　 (二)HSP基因的设计　　 用柔性肽作为Linker串联各抗原表位,根据遗传中心法则将氨基酸序列转化为基因序列,在基因两端加入起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)、免疫刺激序列CpG(GACGTT)及酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,构建成线性的多表位嵌合基因——HSP基因。　　 (三)HSP多表位基因所编码蛋白的结构分析　　 采用DNASTAR、PREDICTED ANTIGENIC PEPTIDES生物软件及在线预测网站Expasy(http://us.expasy.org/)对HSP多表位基因所编码蛋白的二级结构及亲水性、柔性、抗原性、表面可及性进行分析。　　 二、化学人工合成HSP多表位嵌合基因　　 由上海旭冠生物科技发展有限公司化学人工合成HSP基因并构建质粒pET32α-HSP,采用酶切法和测序方法鉴定合成序列的正确性。　　 三、HSP多表位基因原核表达载体的构建及表达产物抗原性分析　　 (一)pGEX6p-1-HSP原核表达载体的构建　　 用限制性内切酶BamHⅠ/XhoⅠ双酶切pET32α-HSP及pGEX6p-1质粒,回收HSP基因和开环的pGEX6p-1质粒。用T4连接酶将二者连接,构建pGEX6p-1-HSP原核表达载体,EcoRV/PstⅠ双酶切鉴定。　　 (二)pGEX6p-1-HSP表达产物的抗原性分析　　 原核表达pGEX6p-1-HSP重组蛋白,常规方法SDS-PAGE电泳,以多克隆兔免疫血清和恢复期HFRS病人阳性血清为一抗分别进行Western-blotting,分析其抗原性。　　 四、HSP多表位基因真核表达载体的构建及瞬时表达　　 (一)pcDNA3.1-HSP真核表达载体的构建　　 BamHⅠ/XhoⅠ双酶切pET32α-HSP及pcDNA3.1(+)质粒,回收HSP基因和开环的pcDNA3.1(+)质粒。用T4连接酶将二者连接,构建pcDNA3.1-HSP真核表达载体,PstⅠ酶切鉴定。　　 (二)pcDNA3.1-HSP转染vero-E6细胞　　 真核表达载体pcDNA3.1-HSP以脂质体Lipofectamine2000为介导转染vero-E6细胞。　　 (三)转录产物的RT-PCR检测　　 提取总RNA,逆转录合成cDNA,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测转录产物。　　 (四)表达产物的间接免疫荧光检测　　 间接免疫荧光检测表达产物,以1:160稀释兔抗-HSP多克隆免疫血清和1:80恢复期HFRS病人血清为一抗。　　 五、HSP多表位DNA疫苗免疫活性的研究　　 (一)动物免疫方案　　 Balb/c纯系小白鼠每组各30只,采用0d、14d、28d3针免疫程序。每次免疫前24 h在小鼠股四头肌肌注0.75％布比卡因10μL。HSP多表位DNA疫苗100μg、HSP重组蛋白50μg免疫小鼠。免疫后定期对小鼠采血分离血清,取脾、心、肝、肾、注射局部肌肉组织,-20℃2保存。分组情况如下:　　 (二)ELISA法检测免疫鼠血清IgG抗体及细胞因子　　 酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫鼠血清细胞因子干扰素-γ(Interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)与IgG抗体及亚型IgG1、IgG2a的水平。　　 (三)MTT法检测免疫鼠脾淋巴细胞增殖　　 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测免疫鼠脾淋巴细胞增殖。　　 六、HSP多表位DNA疫苗的分布及基因组整合安全性检测　　 (一)HSP多表位DNA疫苗的分布检测　　 设计引物3对,分别覆盖HSP基因的前、中、后三部分,以确保检测准确性。PCR法检测HSP多表位DNA疫苗在免疫鼠体内分布情况。　　 (二)HSP多表位DNA疫苗与小鼠基因组整合安全性检测　　 以1％琼脂糖凝胶电泳纯化小鼠基因组DNA,按上述分布检测的反应条件及引物进行PCR扩增,检测DNA疫苗基因是否与小鼠细胞基因组发生整合。　　 结果：　　 一、抗原表位预测结果及HSP基因合成　　 筛选HNTV、SEOV、PUUV包膜糖蛋白G2的抗原表位25个,以柔性肽作为Linker串联起来,在基因两端加入起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)、免疫刺激序列CpG(GACGTT)及酶切位点BamHⅠ和XhoⅠ,构建成HSP嵌合基因,全长1542 bp,由上海旭冠生物科技发展有限公司化学人工合成。酶切及测序鉴定结果与设计完全相符　　 二、HSP多表位基因编码蛋白质的结构特征分析　　 采用生物信息学软件分析HSP多表位基因编码蛋白质,亲水性和独立抗原区域较多,柔性区域分布广,二级结构中β转角及无规则卷曲共占58.94％。　　 三、HSP多表位基因原核表达载体的构建及表达产物抗原性分析　　 (一)原核表达载体pGEX6p-1-HSP的鉴定　　 原核表达载体pGEX6p-1-HSP经PstⅠ/EcoRⅤ双酶切后产生三个片段,分别为2.9kb、2.2kb、1.4kb,与预期结果完全相符。　　 (二)原核表达产物抗原性分析　　 原核表达产物HSP重组蛋白可分别与多克隆兔免疫血清和恢复期HFRS病人阳性血清发生反应,有74kD蛋白条带,表明具有较好的抗原性。　　 四、HSP多表位基因真核表达载体的构建及瞬时表达　　 (一)真核表达载体pcDNA3.1-HSP的鉴定　　 真核表达载体pcDNA3.1-HSP经PstⅠ酶切后产生两个片段,分别为5.1kb、1.7kb,与预期结果完全相符。　　 (二)瞬时表达　　 RT-PCR及间接免疫荧光检测pcDNA3.1-HSP可在vero-E6细胞中瞬时表达。　　 五、HSP多表位DNA疫苗免疫活性的研究　　 HSP多表位DNA疫苗组细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平与淋巴细胞增殖活性高于对照组(P＜0.01);IgG特异性抗体高于对照组(P＜0.01),分型检测IgG1、IgG2a均升高,IgG2a水平高于IgG1。　　 六、HSP多表位DNA疫苗与HSP重组蛋白联合免疫方案评价　　 DDH组经蛋白加强免疫后细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平及IgG水平、淋巴细胞增殖活性高于HHD组、DDD组和HHH组(P＜0.05)。IgG抗体分型检测,DDD组和DDH组IgG2a水平高于IgG1(P＜0.01),HHH组和HHD组IgG1水平高于IgG2a(P＜0.01)。　　 七、HSP多表位DNA疫苗的分布及整合安全性检测　　 HSP多表位DNA疫苗在小鼠体内持续分布达到60d以上,未检测到DNA疫苗与小鼠基因组DNA有整合的现象。　　 结论：　　 1、筛选出HTNV、SEOV、PUUV包膜糖蛋白G2的B细胞和T细胞表位25个,设计构建了HSP多表位嵌合基因并采用化学人工合成;　　 2、生物信息学软件分析HSP多表位基因编码蛋白亲水性和独立抗原区域较多,柔性区域及表面可及性区域分布广,二级结构中β转角及无规则卷曲共占58.94％;　　 3、构建了HSP多表位基因的原核表达载体pGEX-6p-1-HSP,表达并纯化了HSP重组蛋白,Western-blotting分析具有良好的抗原性。　　 4、构建了HSP多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1-HSP,并在哺乳动物细胞veto-E6中进行瞬时表达;　　 5、动物免疫实验表明HSP多表位DNA疫苗能够诱导细胞免疫和体液免疫,以细胞免疫为主,具有良好的免疫活性;　　 6、HSP多表位DNA疫苗在小鼠体内持续分布达到60d以上,未检测到DNA疫苗与小鼠基因组DNA有整合的现象;　　 7、联合免疫结果显示,两次HSP多表位DNA疫苗初免联合一次HSP重组蛋白加强免疫增强了疫苗的免疫效果,是最佳的免疫方案。