论文部分内容阅读
HPG轴在家禽生殖发育和功能维持过程中扮演重要角色,位于HPG轴顶端的下丘脑接受经中枢神经系统分析与整合后的各种信息后,分泌GnRH刺激垂体前叶分泌GTH,促进性腺的发育和甾体激素的分泌。近年来研究发现,脂肪组织不但是动物机体重要的储能组织,也是一个活跃的内分泌器官,它分泌多种脂肪因子,其中一种便是AdipoQ,AdipoQ的生物学作用是通过AdipoRs介导实现的。AdipoQ及其受体在不同动物的下丘脑、垂体、性腺、子宫、胚胎等多种生殖腺和生殖组织中表达,说明AdipoQ及AdipoRs在调控动物生殖及胚胎生长发育方面起重要作用。目前,AdipoQ及AdipoRs对哺乳动物HPG轴的作用已经证实,但在家禽领域相关报道较少,并且研究偏重于性腺组织中的表达和作用,而对中枢系统（下丘脑-垂体）的表达和调控未见报道。因此,本试验以海兰褐蛋鸡为试验材料培养原代下丘脑神经元,来研究AdipoQ及AdipoRs对蛋鸡下丘脑神经元生殖激素分泌和相关受体表达的影响,阐明其作用靶点和调控机制,为完善家禽生殖调控理论奠定基础。1、AdipoQ和AdipoRs在蛋鸡下丘脑中的表达分布以及与GnRH神经元的形态学关系本试验中采集（8只）45周的海兰褐蛋鸡下丘脑组织样品,通过免疫组织化学方法和免疫荧光双标记法对脂联素及其受体的定位、脂联素受体与促性腺激素释放激素（GnRH）神经元的形态学关系进行研究。结果表明,AdipoQ和AdipoR2定位于调节摄食和能量平衡的下丘脑主要核团,即下丘脑外侧区（LHA）、漏斗核（IN）、背内侧核（DMN）和室旁核（PVN）;AdipoR1和AdipoR2定位于IN和DMN的GnRH神经元。综上所述脂联素及其受体可能在整合能量平衡和生殖的内分泌网络中发挥着重要作用。2、过表达或干扰AdipoQ对蛋鸡下丘脑神经元生殖激素及相关受体表达的影响本试验中成功培养并鉴定蛋鸡原代下丘脑神经元,通过qRT-PCR、ELISA和WB技术研究,验证了下丘脑神经元中成功过表达和干扰AdipoQ基因。结果表明过表达AdipoQ后GnRH m RNA显著下降（P＜0.05）,AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR和FSHR m RNA显著上升（P＜0.05）;干扰AdipoQ后GnRH m RNA显著上升（P＜0.05）,AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR和FSHR m RNA显著下降（P＜0.05）。综上所述过表达AdipoQ会抑制GnRH基因的产生,干扰AdipoQ会促进GnRH基因的产生;激素以及蛋白水平与基因趋势保持一致。3、过表达或干扰AdipoQ对蛋鸡下丘脑神经元潜在信号通路的影响本试验中培养蛋鸡原代下丘脑神经元,通过qRT-PCR和ELISA技术研究,结果表明单独添加Compound C（AMPK抑制剂）,AMPK、AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR、FSHR m RNA下降,GnRH m RNA显著上升（P＜0.05）;过表达或干扰AdipoQ和Compound C（AMPK抑制剂）共处理,发现AdipoQ可能通过AMPK信号通路抑制GnRH的产生,对AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR和FSHR m RNA都有一定的影响。单独添加LY294002（PI3K抑制剂）,PI3K、AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR、FSHR m RNA下降,GnRH m RNA显著上升（P＜0.05）;过表达或干扰AdipoQ和LY294002（PI3K抑制剂）共处理,发现AdipoQ可能通过PI3K信号通路抑制GnRH的产生,对AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、ER、PR、LHR和FSHR m RNA都有一定的影响。4、干扰AdipoRs和AdipoRon共处理对蛋鸡下丘脑神经元生殖激素及相关受体表达的影响本试验中通过CCK-8、qRT-PCR、ELISA和WB技术研究,确定AdipoRon（脂联素受体激动剂）的安全浓度范围,以及验证了下丘脑神经元中成功干扰AdipoR1和AdipoR2基因。在细胞72小时,AdipoRon浓度为5μg/ml时和干扰AdipoR1或AdipoR2共处理后,AdipoRon对AdipoR1和AdipoR2的干扰有一定的抑制作用;单独添加AdipoRon、单独干扰AdipoR1或AdipoR2以及共处理对AdipoQ、AdipoR1、AdipoR2、GnRH、ER、PR、LHR和FSHR m RNA都有一定的影响。综上所述单独添加AdipoRon、单独干扰AdipoR1/AdipoR2以及共处理均会抑制GnRH的产生,激素以及蛋白水平与基因趋势保持一致。以上结果表明,脂联素及其受体可能在整合能量平衡和生殖的内分泌网络中发挥着重要作用,过表达AdipoQ可能通过AMPK和PI3K信号通路抑制GnRH的分泌,干扰AdipoQ可能通过AMPK和PI3K信号通路促进GnRH的分泌,AdipoRon对AdipoRs的干扰有抑制作用,单独添加AdipoRon、单独干扰AdipoRs和共处理对相关生殖基因以及GnRH的分泌都有一定的影响。