桂枝、夏枯草水提物体外抗寨卡病毒药效评价研究

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目的:近年来,寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在世界范围内流行,并引起先天性小头畸型、格林-巴利综合征等重大疾病,给人类带来了严重的危害,然而,目前尚无有效的抗寨卡病毒药物上市,寻找抗寨卡病毒药物迫在眉睫。在我国,中药已有几千年的应用历史,中医在治疗疾病时具有其独特的优势。本课题组前期建立了中药抗寨卡病毒的筛选体系,并对多种中药提取物进行抗寨卡病毒药效筛选,发现桂枝和夏枯草水提物可能具有较好的抑制寨卡病毒作用。本研究对桂枝、夏枯草水提物体外抗寨卡病毒作用展开评价,探讨其抗寨卡病毒可能的作用阶段,为后期中药抗寨卡病毒药效物质基础研究奠定基础,为临床应用提供参考依据。方法:1.根据中医临床防治感染性疾病的用药规律,选取桂枝、夏枯草、菊花和野菊花等32味中药作为本项目的研究对象,分别加入6-10倍量水,加热回流30min,真空浓缩,冷冻干燥,制备成水提冻干粉;通过空斑实验测定C6/36细胞扩增的寨卡病毒滴度;建立中药水提物抗寨卡病毒细胞筛选模型,以细胞病变效应(CPE)为评价指标,对32味中药水提物抗寨卡病毒效果进行筛选。2.应用细胞观察法、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法,对桂枝、夏枯草水提物在Vero细胞中的抗寨卡病毒药效进行综合评价。3.通过细胞死亡抑制、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹,评价桂枝、夏枯草水提物在不同给药方式下的抗寨卡病毒药效,探讨其抗寨卡病毒的作用机制。结果:1.提取得到32味中药水提冻干粉,冻干粉得率在1.60%~34.24%之间。测得32味中药水提物在Vero细胞中的半数毒性浓度均大于1000μg/mL。采用空斑实验测得寨卡病毒滴度PFU=1.8×108pfu/mL。对32味中药水提物进行抗寨卡病毒活性筛选,实验结果显示桂枝、夏枯草在50~500μg/mL浓度范围内可明显减轻寨卡病毒诱导的细胞病变,提示两种中药水提物可能具有抗寨卡病毒作用。2.桂枝水提物对Vero细胞的TC50大于4500μg/mL,对HeLa细胞的TC50为3396±1.03μg/mL,夏枯草水提物在Vero细胞和HeLa细胞中的TC50分别为1886±1.11μg/mL和2112±1.02μg/mL。应用全程给药的方式对桂枝、夏枯草水提物进行抗寨卡病毒作用评价,结果显示,桂枝、夏枯草水提物在50~500μg/mL浓度范围内可明显减少寨卡病毒诱导的细胞病变,桂枝水提物在100μg/mL可显著抑制寨卡病毒核酸的复制和蛋白的表达,夏枯草水提物在200μg/mL可显著抑制寨卡病毒核酸的复制和蛋白的表达,提示桂枝、夏枯草水提物在细胞水平可抑制寨卡病毒复制。3.不同给药模式下桂枝、夏枯草水提物对寨卡病毒引起的细胞死亡均具有剂量依赖性的抑制作用。预混给药时,桂枝水提物在Vero细胞上的治疗指数SI>180,在HeLa细胞上SI=45.89,夏枯草水提物在Vero细胞上SI=10.88,在HeLa细胞上SI=46.39。同时给药时,桂枝水提物在Vero细胞上SI>12.33,在HeLa细胞上SI>67.92,夏枯草水提物在vero细胞上SI>12.57,在HeLa细胞上SI>8.45。治疗给药时,桂枝水提物在Vero细胞上SI>20.93,在HeLa细胞上SI=8.89,夏枯草水提物在Vero细胞上SI=10.83,在HeLa细胞上SI=12.14。结果显示,桂枝水提物预混给药抗寨卡病毒核酸复制作用最优,同时给药次之;夏枯草水提物预混给药抗寨卡病毒核酸复制作用最优,治疗给药次之。4.预混给药和同时给药时,桂枝水提物在25μg/mL时对寨卡病毒蛋白表达有明显的抑制作用,治疗给药在50μg/mL时影响寨卡病毒蛋白的表达。夏枯草水提物预混给药和治疗给药时分别在25μg/mL和100μg/mL时对寨卡病毒蛋白表达有明显的抑制作用,而同时给药对寨卡病毒蛋白的表达影响不明显。结果显示,桂枝水提物预混给药抗寨卡病毒蛋白表达作用最优,同时给药次之;夏枯草水提物预混给药抗寨卡病毒蛋白表达作用最优,治疗给药次之。结论:本研究建立了适用于中药水提物抗寨卡病毒的筛选体系,发现桂枝、夏枯草水提物具有良好的抗寨卡病毒作用。对桂枝、夏枯草水提物的抗寨卡病毒作用进行评价,通过多种方式给药对桂枝、夏枯草水提物的抗寨卡病毒作用进行研究,发现桂枝、夏枯草水提物可以减少寨卡病毒诱导的细胞病变,抑制寨卡病毒核酸的复制和蛋白质的表达。桂枝、夏枯草水提物可通过作用于寨卡病毒的复制的早期阶段发挥抗寨卡病毒作用。
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