目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)目前已逐渐成为导致终末期肾病的主要原因之一。统计数据显示,目前我国糖尿病的患病率可达11.6%(近2亿人),其中约20%-40%的糖尿病患者并发DN,给整个社会带来巨大的经济负担。因此,探索DN的发病机制,研究防治DN的有效药物和方法一直是被关注的焦点。DN发病机制非常复杂,但其具体机制目前尚不明确。既往研究发现,高糖刺激诱导线粒体功能紊乱,并产生大量的活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS),在DN的发生发展过程中起到关键性作用。肾小管损伤是DN进展过程中的关键环节,其损伤程度对肾脏预后有非常重要的意义。DN早期在高糖刺激下,肾小管上皮细胞即呈现增生、肥大,继而走向衰老的独特过程,即应激性衰老,表现为p21、p16、胞浆SA-β-Gal的表达上调,端粒缩短和细胞周期停滞,胞核SAHF聚集等,导致肾脏结构损害和功能损伤,说明应激性衰老可能参与DN的发生发展。因此,防治糖尿病肾病应激性衰老,可能是有效延缓DN进展过程重要的研究方向。Sirt3是沉默信息调节因子2表达的同源蛋白家族之一,主要定位在细胞线粒体,Sirt3蛋白具有较强的去乙酰化酶活性,在氧化应激、细胞衰老以及凋亡等方面有重要的调节作用。目前研究认为Sirt3可通过结合并调节Complex I、Complex III的乙酰化水平和活性,减少ROS的生成;并可能通过调节抗氧化剂SOD2、GPx和Prx3等,增加线粒体ROS的清除。我们的前期研究发现,Sirt3可减轻高糖刺激引起的HK-2细胞氧化应激及凋亡,Sirt3可能是干预DN的新靶点。晚近研究发现,Sirt3通过其抗氧化机制,在对抗氧化应激诱导的细胞衰老中发挥重要的作用。抗氧化剂氢通过上调蛋白Sirt3的表达,减轻氧化应激,下调P21、P53、P16等蛋白的表达,继而抑制视网膜衰老。综上所述,Sirt3通过影响氧化应激在细胞衰老这一发展过程中发挥重要的调控作用。Keap1/Nrf2通路是氧化还原过程重要的调控通路。既往研究显示,当细胞受到活性氧自由基等刺激后,Nrf2与Keap1解偶联,Nrf2活化并转运入核,经Maf蛋白介导与ARE结合,激活下游靶基因的表达(包括II相代谢酶、抗氧化酶或药物转运体等),发挥抗氧化损伤的保护作用。Nrf2介导的抗氧化通路的紊乱是导致细胞衰老的驱动力,在骨髓间充质干细胞(MSCs)中,重新激活Nrf2可有效逆转细胞早衰的表型,并恢复动物模型中MSCs的体内活性。吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一种新型的B族维生素,不依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,是氧化还原酶的第三种水溶性辅酶。既往研究证明,PQQ具有的生物学功能多种多样,包括心血管和神经保护作用,促进细胞生长和繁殖,以及作为抗氧化剂来保护细胞免受氧化应激损伤,减轻炎症和细胞衰老。另有研究显示PQQ可增加Hep G2细胞中Sirt1和Sirt3基因的表达和活性。提示PQQ的保护作用可能与Sirt3相关。在本课题中,第一部分我们观察了在糖尿病肾组织及高糖环境下肾小管上皮细胞中Sirt3和应激性衰老相关指标的表达,第二部分经质粒转染过表达Sirt3,进一步观察HK-2细胞在高糖刺激诱导的氧化应激、应激性衰老等方面的改变,探讨糖尿病肾病中Sirt3的作用及机制。此外,我们还研究了Sirt3在吡咯喹啉醌抗氧化应激及细胞衰老过程中的作用,为寻找治疗DN的有效药物提供科学依据。方法:1.糖尿病肾组织及高糖环境下肾小管上皮细胞中Sirt3的表达及意义选取经肾穿刺病理确诊为糖尿病肾病的患者(DN组)10例;对照组(NC组)10例,其肾组织标本取自肾肿瘤患者切除肾脏的远离肿瘤部分的正常肾组织,肾组织常规应用石蜡作包埋,4μm切片,免疫组织化学法检测各组Sirt3、P16的表达,免疫荧光共染检测DN组患者Sirt3和P16的共表达情况。人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)被分为正常糖对照组(NG,5.5m M D-glucose)、甘露醇对照组(M,甘露醇浓度24.5mmol/L,5.5m M D-glucose)和高糖组(HG,30m M D-glucose)分别培养6h、12h、24h、48h、72 h,指定的时间刺激结束后收集细胞,SA-β-Gal检测细胞衰老,提取细胞总蛋白及RNA,Western blot及Real-time PCR等检测Sirt3、P16、P21蛋白的表达。2.基于Keap1/Nrf2通路探讨Sirt3对高糖环境下HK-2细胞应激性衰老的影响及机制应用Lipofectamin 3000和P3000进行质粒转染,HK-2细胞被传至六孔板,转染试剂及质粒采用不同的比例,给予不同的刺激48h,收集细胞,提取蛋白,进行Western blot检测评价转染效果。为了观察过表达Sirt3后对高糖环境下HK-2细胞氧化应激、应激性衰老及相关通路的影响,将细胞分为正常对照组(NG,5.5m M D-glucose)、高糖组(HG,30m M D-glucose)、高糖+空载质粒转染对照组(HG+Control组,30m M D-glucose+p CMV3-vector)、高糖+转染Sirt3质粒组(HG+Sirt3组,30m M D-glucose+p CMV3-Sirt3)。各组细胞刺激48h后,免疫荧光检测线粒体内ROS和膜电位变化,Western blot检测SOD2和CAT蛋白的表达。为了进一步研究Keap1/Nrf2通路是否参与Sirt3对高糖刺激下肾小管上皮细胞保护作用,加入Nrf2特异性抑制剂ML385。观察阻断Keap1/Nrf2通路后,过表达Sirt3对高糖条件下HK-2细胞氧化应激、应激性衰老相关蛋白的表达,我们把HK-2细胞分组:正常对照组(NG,5.5m M D-glucose)、高糖组(HG,30m M D-glucose)、高糖+转染Sirt3质粒组(HG+Sirt3组,30m M D-glucose+p CMV3-Sirt3)、高糖+转染Sirt3质粒+ML385组(HG+Sirt3+ML385组,30m M D-glucose+p CMV3-Sirt3+ML385 5μM)。各组均在刺激48h后,Western blot检测Nrf2及下游蛋白HO-1、NQO-1的表达,以及SOD2、CAT、P16、P21蛋白的表达。3.吡咯喹啉醌对高糖刺激下HK-2细胞应激性衰老的影响及其机制研究为了确定吡咯喹啉醌对高糖环境下HK-2细胞活性的影响,选择合适的浓度进行后续的实验,将HK-2细胞分组为正常对照组(NC,5.5m M D-glucose)、高糖组(HG,30m M D-glucose)、高糖+吡咯喹啉醌1nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌10nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌100nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌500nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌1000nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌10000nmol/L组、高糖+吡咯喹啉醌100000nmol/L组。细胞贴壁后,弃掉原培养基,更换为含有相应浓度的吡咯喹啉醌+高糖培养基,共培养48h后,收集细胞进行实验。为了明确吡咯喹啉醌对高糖环境下HK-2细胞氧化应激、应激性衰老的影响,细胞被分为正常对照组(NG,5.5m M D-glucose)、正常糖+吡咯喹啉醌组(NG+PQQ组,5.5m M D-glucose+PQQ 100n M)、高糖组(HG,30m M D-glucose)、高糖+吡咯喹啉醌组(HG+PQQ组,30m M D-glucose+PQQ 100n M)。各组均刺激48h,行免疫荧光检测,或收集蛋白及RNA,进行Western blot检测蛋白SOD2、CAT、P16、P21等的表达。为了研究沉默Sirt3后吡咯喹啉醌对高糖环境下HK-2细胞氧化应激、应激性衰老及相关通路的影响,我们把HK-2细胞分组:正常对照组(NG,5.5m M D-glucose)、高糖组(HG,30m M D-glucose)、高糖+吡咯喹啉醌组(HG+PQQ组,30m M D-glucose+PQQ 100n M)、高糖+吡咯喹啉醌+Sirt3-si RNA组(HG+PQQ+si RNA组,30m M D-glucose+PQQ100n M+Sirt3-si RNA)。各组均在刺激48h后,Western blot检测SOD2、CAT、P16、P21等蛋白的表达。结果:1.糖尿病肾组织中Sirt3的表达免疫组化结果显示,对照组肾组织可见Sirt3蛋白表达明显,与对照组相比较,DN组Sirt3的表达明显减少,Sirt3主要在肾小管上皮细胞表达分布,肾小球及肾间质不明显。P16的免疫组化结果显示:对照组肾组织P16蛋白的表达水平低下,与对照组相比,DN组肾组织中蛋白P16在肾小球、肾小管及间质中的表达明显增加。免疫荧光共染结果显示DN患者肾组织Sirt3表达较多的肾小管中,P16的表达少,而Sirt3表达较少者,P16的表达明显增多。2.高糖刺激条件下肾小管上皮细胞中Sirt3的表达1)免疫荧光检测结果显示,Sirt3的荧光定位主要在细胞质,与NG组相比较,高糖条件下刺激48h,Sirt3的荧光表达明显减弱。Western blot和Real-time PCR结果显示,Sirt3的表达随高糖刺激时间而变化,呈现先升高而后降低的趋势。与NG组相比较,M组的表达无明显差异,高糖条件下刺激6h,Sirt3的表达明显升高,至12h时表达最多,而后表达逐渐减少,至48h时表达显著减低(P<0.05),差异具有统计学意义。2)Western blot结果示,与对照组相比,HK-2细胞在高糖条件下刺激12h时蛋白P16、P21的表达开始增加,48h时基本达到高峰,呈现时间依赖性趋势。与对照组相比较,HK-2细胞高糖刺激48h时蛋白P16和P21的表达明显增加(P<0.05),差异存在统计学意义。进一步对不同环境下的细胞进行SA-β-Gal染色,结果显示,与对照组相比较,细胞在高糖条件下刺激48h,SA-β-Gal表达阳性的细胞明显增加。3.Sirt3通过Keap1/Nrf2通路减轻高糖条件下HK-2细胞应激性衰老1)转染实验采用Lipofectamin 3000 3.75ul+p CMV3-Sirt3 2ug+P30005ul这一比例进行转染。2)Western blot结果示,高糖条件下蛋白SOD2和CAT的表达随刺激时间而变化,均呈现先升高而后降低的趋势。与NG组相比较,高糖条件刺激48h,HK-2细胞中蛋白SOD2和CAT的表达均显著降低(P<0.05),而经质粒转染过表达Sirt3,可使二者的表达量增加,差异具有统计学意义。与NG组相比较,HG组细胞内和线粒体内ROS表达明显增加,过表达Sirt3后可以减少细胞总ROS及线粒体内ROS的蓄积。JC-1结果显示,在NG组细胞中,红色荧光明显强于绿色荧光,高糖条件刺激48h后,JC-1绿色荧光明显增强,红色荧光明显减少;而过表达Sirt3后,高糖环境下刺激的细胞红色荧光有所增强,说明高糖刺激可使HK-2细胞线粒体膜电位显著降低。当过表达Sirt3后,恢复了高糖刺激诱导的线粒体膜电位的降低。3)Western blot显示,与NG组相比较,HG组细胞中P16和P21蛋白的表达均明显升高(P<0.05),而过表达Sirt3使高糖条件下HK-2细胞P16和P21蛋白的表达减少。SA-β-Gal结果显示,过表达Sirt3后,因高糖刺激诱导的SA-β-Gal表达阳性的细胞数明显减少。4)Western blot结果显示,HK-2细胞Keap1、Nrf2及其下游蛋白NQO-1、HO-1的表达随高糖刺激时间而变化。Nrf2、NQO-1、HO-1均呈现为先升高而后降低的趋势,高糖刺激6h时即可引起三者表达升高,一直持续,至24h时逐渐下降,48h时表达明显减低。5)与NG组相比较,HG组的细胞中Nrf2、胞核Nrf2蛋白、NQO-1、HO-1的表达均明显减少,而Keap1蛋白的表达增加(P<0.05),与HG组相比较,过表达Sirt3使高糖环境下HK-2细胞中Nrf2、NQO-1、HO-1、核Nrf2蛋白的表达明显增加,Keap1蛋白的表达减少(P<0.05)。6)加入ML385后,过表达Sirt3对Keap1/Nrf2信号通路的活性及其下游NQO-1、HO-1蛋白的增强作用被显著抑制。与HG+Sirt3组相比较,加入ML385后,SOD2和CAT蛋白的表达明显减少,而衰老相关蛋白P16和P21的表达明显增加。4.吡咯喹啉醌对高糖条件下HK-2细胞应激性衰老的影响及机制研究1)在NG培养条件下,10、100、500、1000和10000n M的吡咯喹啉醌可显著提高HK-2细胞活性(P<0.05),然而在100000n M时,吡咯喹啉醌抑制了HK-2细胞的活性(P<0.05)。在高糖培养48h时,HK-2细胞活性被显著抑制。10、100、500、1000和10000n M浓度的吡咯喹啉醌可保护HK-2细胞免受高糖诱导的细胞活性减低(P<0.05),后续的实验中以吡咯喹啉醌浓度为100n M被用于进一步的研究。2)与NG组相比较,HG组细胞中SOD2和CAT蛋白的表达均显著减低,且SOD活性明显降低,细胞和线粒体中的ROS水平升高。与HG组相比较,在HG+PQQ组细胞中,抗氧化蛋白的表达显著上调(P<0.05),且细胞和线粒体中的ROS积聚减少。3)与NG组相比较,高糖刺激48h可使HK-2细胞中P16和P21蛋白的表达显著增加(P<0.05),SA-β-gal阳性细胞数增多。与HG组相比,HG+PQQ组蛋白P16和P21的表达均降低(P<0.05),SA-β-gal阳性细胞明显减少。4)免疫荧光显示,与HG组相比,HG+PQQ组的细胞中Sirt3荧光强度明显增加。Western blot、Real-time PCR结果示,与NG组相比,HG组Sirt3蛋白和m RNA水平均降低(P<0.05)。而HG+PQQ组,高糖对Sirt3的抑制作用被部分逆转(P<0.05)。5)转染Sirt3-si RNA后显著抑制了HK-2细胞中Sirt3蛋白的表达。与HG+PQQ组相比,经si RNA沉默Sirt3后,高糖和吡咯喹啉醌共培养下的HK-2细胞中SOD2和CAT蛋白的表达减少(P<0.05),P16、P21的表达显著增加(P<0.05),细胞和线粒体中ROS的增加。6)与NG组相比较,高糖刺激48h后,HK-2细胞中Nrf2、GPx-3、GST、HO-1和NQO-1蛋白的表达均明显下调(P<0.05),免疫荧光显示Nrf2信号减低。与HG组相比较,高糖及吡咯喹啉醌共培养后HK-2细胞中Nrf2及其下游蛋白、核Nrf2的表达明显增加,Realtime PCR结果也提示吡咯喹啉醌能上调Nrf2 m RNA的水平。结论:1.糖尿病患者肾组织及高糖环境下HK-2细胞中Sirt3的表达显著降低,应激性衰老相关蛋白的表达增加,Sirt3可能参与糖尿病肾病应激性衰老的过程。2.经质粒转染过表达Sirt3,可显著降低高糖环境下HK-2细胞应激性衰老。3.在高糖环境下HK-2细胞中,Sirt3通过激活Keap1/Nrf2信号通路及其下游蛋白的表达,发挥抗氧化应激及衰老的作用。4.吡咯喹啉醌可降低高糖环境下HK-2细胞中氧化应激和应激性衰老。5.吡咯喹啉醌可通过上调Sirt3的表达及激活Keap1/Nrf2通路的活性发挥抗氧化应激及抗衰老的保护作用。