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面粉及面制品颜色是重要的品质性状,克隆颜色性状相关基因,并深入分析其表达机理对于小麦品质改良具有重要意义。本研究利用PCR技术筛选普通小麦小偃54基因组BAC文库,获得了籽粒多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)和八氢番茄红素合酶(Phytoene synthase,PSY)基因,分析了籽粒不同发育时期PPO和PSY基因的表达模式,阐述了Ppo-A1基因的选择性剪接分子机制。此外,同源克隆了普通小麦第五同源群染色体上的ζ-胡萝卜素异构酶(ζcarotene isomerase,Z-ISO)基因。主要结果如下：1.在同源克隆基础上,根据普通小麦Ppo-A1、Ppo-B1和Ppo-D1基因的序列信息设计保守引物,利用PCR技术筛选普通小麦小偃54基因组BAC文库,共得到7个阳性BAC克隆,其中207-2-3、207-3-3、207-12-1和910-9-4阳性克隆来源于2A染色体；780-4-7阳性克隆含Ppo-B1a基因,来源于2B染色体；1376-2-3和1376-4-1则来源于2D染色体。利用Sau3A I分别对207-12-1、780-4-7和1376-2-3阳性克隆进行酶切消化,回收3-6kb质粒DNA片段,构建了含有768个、1182个和768个单克隆的亚克隆文库。PCR筛选亚克隆并测序,获得了2A、2B和2D染色体上包含启动子和3’UTR等调控区序列信息的PPO基因,长度分别为5,447bp、10,073bp和4,295bp。图位克隆获得的Ppo-A1、Ppo-B1和Ppo-D1基因编码区与同源克隆序列一致,证实了小麦基因同源克隆的可行性,同时获得了基因启动子和3’UTR调控区完整的序列信息。2.对开花后不同发育时期的小麦籽粒进行L-DOPA完整籽粒染色和PPO蛋白活性检测,表明在籽粒发育后期及成熟种子中,具有Ppo-A1a等位基因品种的籽粒染色密度和PPO蛋白活性明显高于具有Ppo-A1b等位基因的品种。在籽粒发育早期(开花后7天),具有Ppo-D1a等位基因的品种PPO蛋白活性稍高于具有Ppo-D1b等位基因的品种。小麦籽粒发育初始阶段籽粒染色密度和PPO蛋白活性较低,随后染色密度和PPO活性逐渐升高。低温保存1年后的成熟籽粒染色密度和PPO活性达到最高。3.采用半定量RT-PCR技术分析了4个高PPO活性和4个低PPO活性普通小麦品种Ppo1基因的时空表达模式。Ppo-A1基因在籽粒中特异表达,且在开花后14-28天表达水平最高,随着籽粒成熟表达水平迅速降低。在籽粒发育过程中,Ppo-A1a等位基因品种的基因表达水平高于Ppo-A1b等位基因品种。第一内含子191bp插入序列和第二外显子C/G SNP导致Ppo-A1b基因前体mRNA产生选择性剪接,形成8种转录本。只有组成性转录本编码的多肽链可以合成完整PPO蛋白,其余7种转录本均含有提前终止密码子。Ppo-D1b基因表达模式与Ppo-A1基因类似,但Ppo-D1a基因在开花后7天籽粒发育时期有较高转录表达水平,随之降至低水平稳定表达。应用原核表达体系成功地表达了Ppo-A1基因,获得了分子量约67kDa的重组PPO蛋白。利用Western Blotting技术初步鉴定了籽粒发育时期PPO基因蛋白水平表达模式。4.根据普通小麦Psy-Ai、Psy-B1和Psy-D1基因的序列信息设计保守引物,利用PCR方法筛选小偃54基因组BAC文库,共得到7个阳性BAC克隆,287-11-4、436-12-6、988-6-8、808-2-6、1083-5-5、900-12-7和1036-10-7。808-2-6和1083-5-5来源于7B染色体,900-12-7和1036-10-7来源于7D染色体。但未获得7A染色体上Psyl基因的BAC阳性克隆。分别构建1083-5-5和900-12-7BAC克隆的亚克隆文库,筛选含Psyl基因阳性亚克隆并测序,获得了长度为9,173bp和5,073bp包括启动子和3’UTR调控序列的Psy-B1和Psy-D1基因。5.采用半定量RT-PCR技术分析了Psy-A1基因的转录表达模式。Psy-A1基因表达水平随籽粒发育呈动态变化模式,其mRNA丰度在籽粒发育早期具有较高水平,开花后21天迅速降低至较低水平,直至开花后35天时方恢复至较高水平。利用锚定于第三外显子和3’UTR区的引物检测Psy-A1a与Psy-A1b等位基因在籽粒各发育时期的mRNA丰度,发现两类品种的mRNA丰度无明显差异。6.利用同源克隆策略成功克隆了普通小麦第五同源群染色体上Z-ISO基因,获得了5D染色体上Ziso-D1基因全长编码序列,以及5A和5B染色体上Ziso-A1和Ziso-B1位点的部分序列。Ziso-D1a基因ORF全长3,250个核苷酸碱基,含4个外显子和3个内含子。在普通小麦品种中国春、中优9507和CA9632中分别鉴定了Ziso-A1基因位点的3个等位变异,即Ziso-A1a、Ziso-A1b和Ziso-A1c。