荧光探针具有响应快速、灵敏高效、检测限低、成本经济等优势,被广泛应用于基因测序、早期疾病诊断、生物分析、食品检测等领域。基于支点介导的链置换技术所构建的荧光生物传感器,不仅具备上述优势,还提高了荧光探针的可编程性,有效的增强了对复杂目标的识别能力。同时,它能与核酸适配体、DNA逻辑电路和酶催化等技术良好结合,拓宽了多种生物分析物的检测识别范围。目前该机制在支点激活和调控方面还存在短板,其支点区域具有碱基序列依赖性,且支点稳定性不高,设计步骤繁琐,不利于应用范围广的荧光生物传感器的构建。针对目前问题,本论文设计了一种基于交叉支点介导DNA链置换的荧光探针,并应用在单碱基错配识别和目标寡核苷酸的识别。通过交叉支点等多种方案激活后续链置换反应,实时荧光监测和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验表明了该方案的可行性。具体研究工作如下:(1)交叉支点的构建及DNA链置换反应的研究:我们构建了一种新型交叉支点介导链置换机理,该交叉支点是由两组DNA序列完全独立的寡核苷酸链R和T组成,激活下一步DNA链置换反应并调控链置换反应速率。对多条寡核苷酸的单碱基错配试验和支点长度影响链置换速率实验,优化了该体系的识别能力和链置换反应效率,可用于多条碱基序列微小差异的寡核苷酸区分和识别,线性检测范围为1 n M-100 n M,验证了该体系具有良好的选择性和可调控性,给识别检测寡核苷酸中的单碱基错配提供了一种可能。同时进行了链置换实时动态速率可控实验,表明该体系具有良好的可调节性,可参与构建多种生物传感器体系。随后进行了与生物酶协作激活支点介导链置换反应实验,进而证明了该传感器体系具有与其他策略结合的通用性,显示出对生物分析应用的价值。(2)基于交叉支点的高级DNA荧光开关的研究:我们基于交叉支点的链置换,设计了多种DNA荧光开关。首先结合DNA逻辑电路开发了一种高级DNA荧光开关,该荧光开关可以催化地将“DNA燃料链”转换为荧光输出信号,可对复杂溶液中的低浓度目标DNA链,通过燃料链将荧光信号放大从而进行精确识别。我们还设计了基于DNA逻辑电路“AND”门的串联逻辑门生物荧光传感器,在FQJ三链底物的基础上增加2条寡核苷酸J-1、J-2,形成DNA链串联锁扣结构,由多个输入链和荧光输出信号组成。通过输入链串联顺序实时荧光实验,输入链需要按照DNA链串联顺序加入并且同时存在,系统才能释放出荧光信号,该DNA链串联逻辑门荧光开关表现出良好的识别性能。我们还对这种基于交叉支点的高级DNA荧光开关不同位置的支点进行考察,第一种是基于双侧支点的DNA荧光开关,支点由RS双链的末端两侧组成,当支点同时存在时,方能置换下对应的猝灭链Q并释放荧光信号。另一种是基于双支点协同的高级DNA荧光开关,双支点由两条完全独立的寡核苷酸T1和T2组成,TI和T2分别通过各自的支点撬下一部分J链,合作把完整的J链置换下来,进而为下一步R链释放出新支点。该两组DNA荧光开关对碱基序列细微差异的靶寡核苷酸均表现出良好的识别和区分,线性检测范围为1 n M-100 n M,说明该荧光开关具有可编程性。