研究背景和目的创面愈合与组织修复,一直都是医学研究的热点和难点之一。创面也是临床上整形外科中最常遇到的一类疾病。如何促进皮肤受损后的修复是我们治疗的主要任务。随着生物技术和分子生物学等高新技术的渗透,创面修复的研究也进入到一个更高更新的阶段。各类创面的基础研究和治疗手段虽然已取得了一些进展,但仍有许多问题没有解决。皮肤受损后其自然愈合过程主要包括肉芽组织形成和创面再上皮化,在创面再上皮化过程中,表皮细胞的迁移是决定创面愈合的关键步骤。该动态过程主要4个步骤:1、延伸,2、粘附,3、收缩,4、解离,涉及表皮细胞与细胞外基质的相互作用,骨架重组,非对称性分裂增殖等,过程复杂,其具体机制远未阐明,是当前世界上创面愈合研究的焦点。我们探讨皮肤受损后影响表皮细胞迁移的调控分子及作用机制,可进一步阐明创面愈合机理,并进行有效干预,对促进皮肤创面愈合具有重要作用,可为临床上促进各类创面愈合及组织修复提供新的方法与策略。当前有研究认为,当皮肤组织损伤以后,由于血管破裂、相关细胞处于高耗氧状态,使得创面微环境处于低氧（Hypoxia）或缺氧（Anoxia）状态,促进创缘和创基细胞分泌多种细胞因子,包括转化生长因子（TGF）,角质细胞生长因子（KGF）,血管内皮生长因子（VEGF）,血小板源性生长因子（PDGF）等的合成和分泌增加,对创面细胞迁移以及创面的愈合起到积极的促进作用。有研究发现,低氧（或缺氧）条件可以促进创面表皮细胞迁移,对创面愈合起到积极的促进作用。但低氧是如何促进表皮细胞的迁移,进行创面的再上皮化,其具体机制远未阐明。细胞迁移是个复杂的细胞学行为,在迁移的每一步骤中,都包含着细胞骨架尤其是微管动力学的变化,需要有一系列的细胞内信号传导和调节,来对微管动力学进行精准的调控。有研究表明,在肿瘤等低氧细胞中,微管等细胞骨架结构会受到破坏;缺氧可引起VEGF表达升高,并受到微管调节蛋白Stathmin的调节;低氧环境下可影响细胞骨架变化,促进血管内皮细胞的迁移^[8],并在血管生成中发挥重要作用;我们在国家自然科学基金（项目编号:81101436）的资助下,进行了低氧对表皮细胞迁移能力影响的相关研究,结果表明:表皮细胞在低氧环境下（1%氧浓度）短时间内细胞骨架会发生变化,促使细胞迁移能力增强。表明皮肤受损后形成的低氧环境可通过对微管动力学进行调控,进而促进表皮细胞迁移。与微管动力学相关的分子有起稳定作用的微管相关蛋白（microtubule-associated proteins,MAPs）和促进微管解聚的蛋白包括驱动蛋白Kinesin,Stathmin等家族,在低氧、应力刺激等病理生理条件下,微管稳定/解聚的平衡状态发生变化,发挥了包括细胞迁移在内的多种生物学功能。我们研究也发现:非神经细胞中主要的微管相关蛋白4（microtuble-associate protein 4,MAP4）在低氧环境中的表达会有所变化,且这一变化趋势与细胞骨架状态和细胞迁移变化相吻合。表明低氧状态可调节MAP4,进而影响微管动力学以及表皮细胞的迁移。在前期的研究中,我们已经证实:在低氧环境下,MAP4可以通过调控Tctex-1的表达来影响HaCaT细胞的迁移能力,但具体是什么信号分子控制MAP4来调控表皮细胞迁移的,其机制尚不明确。低氧作为细胞外信号,需要将信号传递到细胞内,通过“细胞膜—细胞内信号—MAP4—细胞骨架变化和迁移能力改变”的途径发挥作用。该过程首先需要通过细胞膜受体将信号传递到细胞内。作为重要的膜蛋白受体家族,G蛋白偶联受体（GProtein-Coupled Receptors,GPCRs）可感知氧张力、激素、神经递质、趋化因子等,参与多种细胞内信号传导过程。受到外界刺激后,GPCRs会发生构象变化,以三磷酸鸟苷（GTP）交换G蛋白上的二磷酸鸟苷（GDP）,激活G蛋白α亚基,参与下一步信号传递过程。根据Gα亚基的功能特性,分为Gα_s,Gα_i,Gα_q和Gα12四类。有研究表明Gα_i1及Gα_i3蛋白可能参与了细胞迁移,这在新近的肿瘤细胞研究中也得到证实。综上所述,本研究拟通过模拟皮肤受损后的局部缺氧微环境,利用各种体外实验方法来观察低氧环境下,Gα_i1通过MAP4调控人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）微管动力学的表达来影响细胞迁移,并试图研究其具体机制。本研究通过建立起HaCaT细胞的相关缺氧模型,并采用基因芯片技术、体外活细胞工作站、体外细胞划痕实验、蛋白免疫印迹（western blot,WB）技术及免疫荧光染色（immumofluorescence,IF）等多种实验技术方法来系统观察在低氧条件下,MAP4在HaCaT细胞中的表达变化情况,细胞微管动力学的变化情况,以及对细胞迁移能力的影响,研究Gα_i1和MAP4的关系,并共同探讨在低氧条件下它们是否通过Akt/mTORC信号通路来对HaCaT细胞迁移能力的产生影响。在上述研究基础上,进一步从临床数据入手,通过收集临床资料,对影响创面外科治疗疗效的因素进行回顾性及描述性分析,得出临床上影响创面外科治疗疗效的具体因素;使得相关分子调控作用机制进一步得到验证。研究方法本研究共分为四部分:第一部分:系统观察并证实低氧微环境可促进表皮细胞迁移的假设1.建立起表皮细胞的低氧处理模型和系统的细胞培养方法:分别将人永生化表皮细胞株（HaCaT细胞）进行常氧及低氧培养,低氧处理培养时放入美国Thermo公司的低氧培养孵箱（1%氧气,5%二氧化碳,94%氮气）,方法较之前使用的简易罐气缺氧装置要高效可靠,细胞生长良好。2.采用细胞体外划痕实验以及活细胞工作站观察并分析在低氧条件下表皮细胞的迁移能力变化:将HaCaT细胞放入低氧培养孵箱（1%氧气,5%二氧化碳,94%氮气）进行低氧培养24h,采用两种体外细胞迁移实验模型（细胞体外划痕实验和活细胞工作站迁移实验）系统观察低氧环境下HaCaT细胞的迁移能力变化。所得结果实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示,利用SPSS12.0统计软件进行统计,采用单因素方差分析,组间比较为t检验,P<0.05为结果具有显著差异,P>0.05为结果无统计学意义。第二部分:利用基因芯片技术检测通过低氧及常氧处理的表皮细胞之间转录组表达差异,找出低氧微环境下通过调控MAP4影响表皮细胞迁移的主要基因及分子信号通路。1.将HaCaT细胞样本分组放入低氧培养孵箱分别处理24h,收集各组细胞RNA,利用基因芯片技术检测各组细胞之间转录组的表达差异。2.对利用基因芯片技术检测到的各样本组细胞之间转录组的基因表达差异进行GO及Pathway分析,找出低氧微环境下通过调控MAP4影响表皮细胞迁移的主要基因及分子信号通路。第三部分:系统观察低氧微环境下关键蛋白G蛋白α亚基1（Gα_i1）和MAP4在HaCaT细胞表达变化及相互作用情况,以及对细胞迁移的影响。1.通过设置4个不同的细胞低氧培养时间点:0.5h、1h、3h及24h,采用WB实验观察Gα_i1和MAP4在HaCaT细胞中的表达变化。2.通过构建Gαi1低表达载体,并转染HaCaT细胞,培养筛选建立稳定的Gαi1低表达HaCaT细胞模型,并复苏前期研究中冻存好的MAP4低表达HaCaT细胞,设置正常组、Gαi1低表达组和MAP4低表达组细胞,采用WB实验观察在低氧培养下Gα_i1和MAP4在HaCaT细胞中的相互作用关系,细胞低氧培养时间点同上。同时利用细胞体外划痕实验和活细胞工作站观察各组细胞的迁移变化情况。第四部分:系统观察Gαi1通过Akt/mTORC信号通路调控MAP4的表达低氧条件下表皮细胞迁移。1.通过构建Gαi1高表达载体和Gαi3高/低表达载体,并转染HaCaT细胞,培养筛选建立稳定的Gαi1高表达和Gαi3高/低表达载体HaCaT细胞模型,设置正常组、Gαi1高/低表达组和Gαi3高/低表达组细胞,细胞低氧培养时间点同上,采用细胞体外划痕实验、Transwell细胞迁移实验及活细胞工作站的方法系统观察分析各组细胞在低氧条件下细胞的迁移能力变化。此外,进一步采用原代细胞培养,干扰Gαi1/3后,观察分析其细胞增殖能力变化。2.设置正常组、Gαi1低表达组分别和高表达组细胞,细胞低氧培养时间点同上,采用WB实验观察分析各组细胞在低氧微环境中Akt/mTORC信号通路相关蛋白的表达变化。进一步采用Akt/mTORC信号通路相关抑制剂处理后,利用WB实验及细胞体外划痕实验观察分析各组细胞在低氧微环境下Akt/mTORC信号通路中各主要蛋白的表达情况及细胞迁移的变化情况。研究结果1.重新改进并成功建立起人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）低氧培养模型和科学培养方法。2.通过活细胞工作站和细胞体外划痕实验结果显示:在低氧条件下（1%氧气,5%二氧化碳,94%氮气）,HaCaT细胞的迁移能力得到了增强（P<0.01）。3.利用基因芯片技术检测并分析出通过低氧处理后的表皮细胞中各转录组的表达差异,并找出低氧微环境下影响表皮细胞迁移的主要基因及分子信号通路:G蛋白α亚基、MAP4及Akt/mTORC信号通路。4.HaCaT细胞经过低氧培养处理后,WB实验结果显示:早期（0.5h-1h）,Gαi1和MAP4在HaCaT细胞中的表达会有短暂性的提高,随着低氧处理时间的延长（3h-24h）,两者的表达会迅速降低,且趋势相似（P<0.01）。5.通过公司成功建立起了Gαi1/3的高、低表达载体,并转染HaCaT细胞,培养筛选建立稳定的Gαi1高/低表达HaCaT细胞模型。WB实验结果显示:在HaCaT细胞中,干扰Gαi1的表达会影响到MAP4及Tctex-1的表达;反之,干扰MAP4的表达也会使Gαi1及Tctex-1的表达降低,两者存在相互作用关系。进一步通过活细胞工作站和细胞体外划痕实验结果表明:干扰MAP4的表达后,HaCaT细胞在正常培养及低氧处理后其细胞迁移能力都会明显受到抑制;反之,干扰Gαi1的表达后,HaCaT细胞的迁移能力也会受到抑制两者具有相似性。6.低氧培养处理24h后,与正常组HaCaT细胞相比,干扰Gαi1组HaCaT细胞中Akt/mTORC信号通路中的各主要蛋白Akt、GSK-3β、S6、4E-BP1等表达均降低,且细胞迁移能力明显下降;进一步通过抑制剂抑制Akt/mTORC信号通路后,发现HaCaT细胞Tctex-1的表达也会随之降低,且细胞迁移能力明显下降。结论:低氧微环境可以调控Gαi1在HaCaT细胞中的表达,从而使细胞的迁移能力得到增强,其作用机制可能是Gαi1通过Akt/mTORC信号通路调控MAP4的表达,进而影响Tctex-1的表达及细胞微管动力学的变化,来共同影响表皮细胞的迁移。