在体外特定的培养条件下,原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)可以重编程为生殖干细胞(embryonic germ cells,EGCs),EGCs具有和ES相似的生物学特性,为再生医学的研究提供了合适的种子细胞。另一方面,在体外,在培养液中加入特定的诱导因子,PGCs可以定向分化为成熟的生殖细胞,这代表了一个研究领域,在生殖生物学上有着举足轻重的地位。本研究以胎兔为研究对象,比较了胎龄、血清和血清替代物,不同浓度和种类的小分子化合物等因素对PGCs分离培养的影响,并探究其生物学特性,完善兔PGCs体外分离培养的条件,为下一步的建系工作做铺垫。1、选取日本大耳白兔E14-E16胎兔为材料,分离培养兔胚胎成纤维细胞(Rabbit embryo fibroblast,REF),通过传代培养,得到数量足、纯度高、活性好的REF。细胞接种后,24 h后第一次换液,以后根据细胞密度,2-3 d进行一次传代。记录每一代的的密度和培养时间,绘制细胞生长曲线。根据慢冻快溶的原则,对REF进行冻存和复苏。得出如下结论:(1)P3-P5代REF含杂细胞较少,数量较多,活性较好,而P1代REF纯度较差,P7、P10代REF,活性较低,前者更适合制作饲养层。(2)经不同时间(30 d、90 d、180 d)冻存,按照本试验的冻存方法,对细胞活力影响不大,尤其P3-P5代REF复苏后,细胞活力较好,且纯度较高,可用于PGCs培养。2、探究兔PGCs体外培养的生物学特性及胎龄、小分子化合物、血清和血清替代物对兔PGCs分离培养的影响。本试验从E10.5-E15.5的日本大耳白兔的胚胎生殖嵴中分离PGCs,通过形态学观察、AKP染色、RT-PCR检测转录因子OCT-4等方法对其进行鉴定,结果显示阳性。将PGCs接种于5× 105REF制成的饲养层上,培养液中加入不同浓度和种类的小分子化合物,以及血清和血清替代物时,得出以下结论:(1)PGCs可以重编程为EGCs,EGCs可以分化为神经样,上皮样细胞和拟胚体。(2)与E12.5,E13.5,E14.5,E15.5d的胚胎生殖嵴相比,从E10.5d和E11.5的胎兔生殖嵴中分离的PGCs,体外培养增殖能力较强,细胞活性较高。(3)基础培养液中添加3uM RA,20 uM FK和100 nM 4OHT时PGCs的集落数量较多,形态特征较好,细胞活性较好;(4)与培养液中加入15%FBS相比,加入15%KSR时,PGCs集落数量较多,形态特征较好。